Introdução

1. Introdução 5

2. Revisão da literatura 8

2.1. Características da estrutura das moléculas de colágeno e suas propriedades que determinam a formação de estruturas macromoleculares ordenadas 8

2.2. Estrutura das fibrilas de colágeno 11

2.3. Embalagem de moléculas em fibrilas, modelos existentes 12

2.3.1. Embalagem de moléculas na direção longitudinal das fibrilas 12

2.3.2. Embalagem de moléculas na direção transversal das fibrilas 15

2.4. Formação de fibrilas de colágeno in vivo 19

2.5. Fibrilogênese de colágeno in vitro. Fatores e parâmetros que influenciam a automontagem de moléculas in vitro: temperatura, pH, força iônica, concentração de moléculas, componentes da matriz extracelular 29

2.5.1. Composição iônica 31

2.5.2. Força iônica 32

2.5.4. Temperatura 32

2.5.5. Concentração 36

2.5.6. Componentes da matriz extracelular 37

2.5.6.1. Glicosaminoglicanos 38

2.6. Distúrbios no empacotamento das moléculas de colágeno, levando a doenças e defeitos dos tecidos conjuntivos 42

2.7.Métodos para estudar fibrilas de colágeno 44

2.7.1. Método de microscopia eletrônica 44

2.7.2. Método de difração de raios X 46

2.7.3. Método de microscopia de polarização 48

2.8. Método de calorimetria 49

3. Materiais e métodos de investigação. .54

3.1. Materiais e reagentes 54

3.1.1. Objetos de pesquisa. 54

3.1.2. Reagentes.. 54

3.2. Isolamento e Purificação de Colágeno 54

3.2.1. Colágeno de pele de porco 55

3.2.2. Colágeno dos tendões da cauda de rato 55

3.2.2.1. Colágeno com telopeptídeos 55

3.2.2.2. Colágeno sem telopeptídeos. 57

3.3. Métodos de pesquisa 57

3.3.1. Eletroforese de amostras de colágeno 57

3.3.2. Determinação da concentração de colágeno 58

3.Z.Z.Métodos ópticos 58

3.3.3.1. Espectroscopia infravermelha 58

3.3.3.2. Espectrofotometria 58

3.3.3.3. Microscopia óptica de polarização 59

3.3.4, Método de calorimetria de varredura 60

3.3.5. Métodos de microscopia eletrônica 61

3.3.5.1. Método de microscopia eletrônica de varredura 61

3.3.5.2. Método de contraste negativo 61

3.4. Formação de fibrilas de colágeno 62

3.4.1. Determinação das características físico-químicas das moléculas de colágeno 62

3.4.2.0otimização das condições iniciais para a fibrilogênese do colágeno w 63

3.4.2.1. Seleção de métodos para formação de fibrilas de colágeno nativas 63

3.4.2.2. Seleção do regime cinético para automontagem de moléculas a uma temperatura de 4C com mudanças de temperatura para 25C, 30C, 35C 65

3.4.2.3. Seleção das condições iniciais para a formação de complexos de colágeno com moléculas de matriz extracelular 65

3.4.3. Busca de condições para formação de fibrilas: seleção de parâmetros fixos e variáveis. 65

4. Resultados e discussão 68

4.1. Efeito da temperatura na fibrilogênese do colágeno tipo I com telopeptídeos removidos 68

4.2. A influência da temperatura e concentração de moléculas de colágeno na cinética de formação de fibrilas 72

4.3. Características termodinâmicas das fibrilas de colágeno, em significados diferentes temperatura e concentração de moléculas de colágeno. 75

4.4. Formação de complexos de colágeno com o componente da matriz extracelular condroitina-4-sulfato dependendo de uma série de condições 83

Conclusão.89

Introdução ao trabalho

A fibrilogênese do colágeno in vivo é um processo complexo e de várias etapas. Primeiro, um precursor do colágeno, o procolágeno, é sintetizado. Depois que os propeptídeos são clivados por enzimas, o procolágeno é convertido em colágeno e secretado pelas células. A automontagem de moléculas de colágeno em fibrilas ocorre na superfície das células. As fibrilas de colágeno se agrupam em fibras no espaço extracelular.

O colágeno é o principal elemento estrutural da matriz extracelular. Existem atualmente 26 tipos geneticamente distintos de colágeno conhecidos. O colágeno tipo I faz parte das fibrilas e fibras da maioria dos tecidos conjuntivos. Distúrbios no empacotamento das moléculas de colágeno tipo I levam a doenças do tecido conjuntivo, como osteoporose, escoliose, síndrome de Ehlers-Danlos, síndrome de Marfan, etc. O aumento da extensibilidade da pele na síndrome de Ehlers-Danlos se correlaciona com um aumento no diâmetro das fibrilas, o que é uma consequência de síntese reduzida de moléculas de colágeno tipo III e proteoglicanos que regulam o empacotamento e o tamanho das fibras de colágeno. Na distrofia muscular, o grau de ordenação das fibrilas e fibras de colágeno é reduzido pela metade em comparação ao normal.

A estrutura ordenada das fibrilas de colágeno tipo I é formada durante a embriogênese, nos estágios iniciais da morfogênese. Durante a formação do tecido, as células se movem ao longo das fibrilas de colágeno. As fibrilas de colágeno tipo I são formadas intensamente após queimaduras e durante a cicatrização de feridas.

Para fibrilas de colágeno tipo I, foi estabelecido um alto grau de ordem na direção longitudinal e descobriu-se que a periodicidade característica da estrutura das fibrilas ao longo de seu comprimento é determinada pelo tipo linear de empacotamento molecular. Até o momento, o empacotamento das moléculas de colágeno na direção transversal das fibrilas foi pouco estudado e, portanto, a estrutura das fibrilas no espaço tridimensional não foi estabelecida.

6 O empacotamento de moléculas de colágeno em fibrilas in vivo é determinado por um número bastante grande de componentes envolvidos nesse processo, bem como por um grande número de fatores regulatórios. A busca por condições para a formação de fibrilas adequadas à fibrilogênese do colágeno in vivo vem sendo realizada há aproximadamente 50 anos. Uma abordagem para estudar a fibrilogênese do colágeno pode ser a criação de sistemas de fibrilogênese in vitro sob condições semelhantes às condições in vivo. Segundo a literatura, foram criados poucos sistemas de automontagem in vitro cujos parâmetros sejam próximos aos in vivo (Holmes, 2001; Christiansen, 2000). A identificação dos parâmetros de formação de fibrilas que determinam o estado funcional e o empacotamento das fibrilas nos permitirá aproximar-nos da compreensão do processo de fibrilogênese in vivo.

Encontrar as condições de fibrilogênese que afetam a densidade de empacotamento das fibrilas possibilita a obtenção in vitro de fibrilas de colágeno nativo com propriedades controladas. Na criação de biomateriais, é necessário um alto grau de ordem e estabilidade das fibrilas de colágeno para manter por muito tempo sua resistência à ação de enzimas proteolíticas. A formação de fibrilas de colágeno em combinação com outras moléculas do tecido conjuntivo é uma importante tarefa biotecnológica.

Finalidade e objetivos do estudo. A fibrilogênese do colágeno é difícil de estudar, pois a estrutura nativa das fibrilas é formada em temperaturas fisiológicas próximas à temperatura de desnaturação das moléculas. In vitro, foram determinados vários parâmetros para a automontagem de moléculas de colágeno e foi encontrado um pequeno número de macromoléculas da matriz extracelular que afetam a fibrilogênese do colágeno. No entanto, o tamanho das fibrilas in vitro excede significativamente o tamanho das fibrilas in vivo, o que é causado por uma densidade de empacotamento molecular mais baixa em comparação com o empacotamento molecular in vivo. O objetivo deste trabalho é estudar a fibrilogênese do colágeno tipo I em condições próximas às fisiológicas. Para buscar parâmetros que caracterizam a fibrilogênese do colágeno in vitro, foram utilizados os princípios de construção de um diagrama de fases. As seguintes tarefas foram resolvidas:

Determinar o efeito da temperatura na cinética de formação de fibrilas de colágeno.

Determinar as características termodinâmicas das fibrilas de colágeno em diferentes temperaturas e concentrações de moléculas.

Estabelecer a contribuição dos glicosaminoglicanos para a formação de fibrilas termoestáveis ​​e resistentes à proteólise.

Avaliar as capacidades do método calorimétrico para estudar a estrutura das fibrilas de colágeno formadas in vitro.

2. REVISÃO DE LITERATURA

Estrutura das fibrilas de colágeno

A estrutura das fibrilas é caracterizada por um arranjo gradual de moléculas com um deslocamento de um quarto de seu comprimento (Fig. 2). Moléculas dispostas em uma linha não estão conectadas nos terminais N e C. Existe um intervalo de 40 nm entre o final de uma molécula e o início da próxima. As imagens de microscopia eletrônica mostram uma alternância de faixas claras e escuras, onde a faixa clara corresponde à área de moléculas sobrepostas (zona de sobreposição), e a faixa escura corresponde à área com lacunas entre as moléculas (zona de lacuna). As fibrilas de colágeno, de acordo com a difração de raios X e a microscopia eletrônica, apresentam um período de estriação cruzada D de 64-67 nm. A análise das sequências de aminoácidos das cadeias polipeptídicas revelou que o período D corresponde ao agrupamento dos aminoácidos em blocos de 234 resíduos de aminoácidos por cadeia a (Hulmes, 1973; Fraser e MacRae, 1987). Existem quatro desses blocos sequenciais em uma molécula de colágeno. A quinta região C-terminal da hélice tripla tem tamanho 0,4D e consiste em 90 resíduos de aminoácidos. Na região C de uma molécula e na região N-terminal sobreposta do mesmo tamanho de outra molécula, os telopeptídeos N e C globulares participam da ligação de moléculas (Scott e Orford, 1981; Vitalgiano et al., 1995) . Os telopeptídeos constituem 2% do peso molecular do colágeno, porém influenciam significativamente a estrutura das fibrilas. A inclusão de telopeptídeos na reticulação de moléculas não só contribui para a formação de fibrilas fortes, mas também preserva a sua flexibilidade. Nessas regiões das moléculas, formam-se ligações covalentes entre a tripla hélice e os telopeptídeos terminais. 2.3. Embalagem de moléculas em fibrilas, modelos existentes. 2.3.1. Embalagem de moléculas na direção longitudinal das fibrilas. Ao contrário de muitas proteínas fibrilares, a formação de fibrilas de colágeno ocorre com o crescimento simultâneo de moléculas nas direções longitudinal e transversal. A ligação das moléculas é regulada pela distribuição de resíduos de aminoácidos que interagem especificamente ao longo da cadeia peptídica. As ligações são formadas tanto entre telopeptídeos globulares e hélices triplas, quanto entre hélices triplas de colágeno. Para interações hélice-hélice, o deslocamento molecular ideal é o período D (Ward et al, 1986). O sítio D na molécula de colágeno é formado principalmente por resíduos de aminoácidos hidrofóbicos e polares. Os aminoácidos hidrofóbicos têm um período de distribuição mais claro que os polares. O período D é o máximo para contatos hidrofóbicos quando as moléculas se ligam às fibrilas. As interações hidrofóbicas minimizam a área superficial das moléculas de colágeno disponíveis para as moléculas de água (Wallace, 1985). A mudança consecutiva das moléculas de colágeno pelo período D fornece uma área suficientemente grande (-200 nm) para interações entre moléculas vizinhas.

Portanto, amarrar no comprimento traz grandes vantagens. Para interações telopeptídeo-helicoidal, um deslocamento molecular de 4 D é ideal (Helseth et al, 1979). O trabalho (Veis, George, 1994) descobriu que o deslocamento de duas moléculas por um período de 4 D está associado à maximização das interações eletrostáticas nas fibrilas. Foi determinado que os valores máximos de cargas positivas e negativas na molécula estão localizados nas extremidades da tripla hélice. Na molécula de colágeno fibrilar tipo II, as regiões Dl, D4 aumentaram a estabilidade e as regiões D2, D3 diminuíram a estabilidade (Arnold et al, 1998). O colágeno é caracterizado por um alto grau de ordenação na direção longitudinal das fibrilas - ordenação de longo alcance. A ordenação eficaz é regulada pela maximização das interações eletrostáticas e hidrofóbicas. Nos processos de fibrilogênese, as interações eletrostáticas predominam sobre as hidrofóbicas, pois nas moléculas de colágeno o número de resíduos de aminoácidos carregados é de 16% e o número de resíduos de aminoácidos hidrofóbicos é de 6% (Brodsky et al., 1995). Os grupos polares na hélice tripla são formados por aminoácidos com cargas alternadas positivas e negativas. Esta distribuição de grupos polares leva à neutralização da carga intramolecular, bem como a fortes contatos intermoleculares. Durante a ligação, forma-se uma rede de cargas positivas e negativas, após a qual a carga negativa e a energia de ligação entre as moléculas podem aumentar (Chapman, 1984). Os resíduos de aminoácidos polares são flexíveis e menos restritos nas suas interações do que os resíduos de aminoácidos hidrofóbicos. Grupos polares de resíduos de aminoácidos formam ligações não apenas entre si, mas também com íons de soluções. Sabe-se que o número de grupos carregados na hélice tripla do colágeno tipo I é 531 (WaIlace, 1990) apresentaram dados (Li et al., 1975; Piez, 1982; Silver, 1982). que durante a formação de fibrilas se ligam 40-150 resíduos de aminoácidos carregados. Isto indica que nem todos os grupos carregados na hélice tripla estão disponíveis para interações entre moléculas. Acredita-se que o mecanismo de empacotamento longitudinal envolva interações entre blocos incomuns de pares carregados localizados na tripla hélice do colágeno nas posições 53, 54, 56 e 990, 992, bem como nas extremidades não helicoidais (Silver, 1982). Pares carregados são atraídos um pelo outro eletrostaticamente ou na forma de aglomerados hidrofóbicos entre moléculas. É provável que os resíduos de aminoácidos polares tenham uma conformação estendida. Como a lisina e a arginina são as cadeias laterais mais longas, é possível que estes resíduos de aminoácidos sejam atraídos para estágios iniciais formação de fibrilas. Antes que ocorra uma interação tão forte, as moléculas de água associadas a esses resíduos devem ser removidas. Aparentemente, este processo ocorre em temperaturas fisiológicas. O alto grau de simetria translacional das fibrilas em relação ao eixo da fibrila, determinado a partir de reflexões meridionais em pequenos ângulos, e o período D regular indicam que os contatos intermoleculares na direção longitudinal são particularmente favorecidos.

Isso se deve às interações complementares entre duas moléculas, bem como a uma distância significativa na direção longitudinal das fibrilas, sobre as quais se estende um tipo periódico de ligação intermolecular. Foram obtidos dados de que a energia livre depende de parâmetros axiais, ou seja, a energia livre mínima é determinada pela componente axial (Wess et al, 1995). Estudos termodinâmicos da formação de fibrilas in vitro em função da densidade das moléculas de colágeno mostraram que o componente entropia dá a principal contribuição para a mudança na energia livre quando as moléculas são incorporadas nas fibrilas. Neste caso, a entalpia do sistema é positiva. Os telopeptídeos globulares N e C-terminais participam da construção de fibrilas no sentido longitudinal. O N-telopeptídeo influencia a formação de dímeros dispostos com um período 4D. Primeiro, o N-telopéptido de uma molécula sofre uma alteração conformacional e liga-se à região helicoidal da molécula vizinha. O telopeptídeo C estabiliza então o empacotamento de moléculas na direção longitudinal, ligando-se à região complementar da tripla hélice. O telopeptídeo C também afeta a associação lateral de agregados lineares. Após a automontagem, os telopeptídeos terminais promovem a ligação secundária de moléculas e a estabilização das fibrilas, formando novas ligações intermoleculares (Wallace, 1990). Assim, os telopeptídeos terminais desempenham um papel essencial tanto nos estágios iniciais da formação das fibrilas quanto no processo de estabilização das fibrilas. Estudos recentes indicam que as moléculas de colágeno não são compactadas paralelamente ao comprimento das fibrilas, mas em um determinado ângulo em forma de espiral. Para avaliar o empacotamento na direção longitudinal das fibrilas, são necessários dados adicionais sobre a estrutura espacial das macromoléculas, incluindo os ângulos de superhelicidade das cadeias α e a orientação radial das moléculas. 2.3.2. Embalagem de moléculas na direção transversal das fibrilas. Todas as interações de moléculas nas fibrilas são geralmente diferenciadas em interações axiais, coincidindo na direção com o longo eixo da fibrila, e interações radiais - laterais.

Distúrbios no empacotamento das moléculas de colágeno, levando a doenças e defeitos dos tecidos conjuntivos

Foi estabelecido que distúrbios no empacotamento das moléculas de colágeno estão associados a muitas doenças do tecido conjuntivo, das quais as mais comuns são osteoporose, escoliose, síndrome de Ehlers-Danlos, síndrome de Marfan, etc. al., 1981; O aumento da extensibilidade da pele na síndrome de Ehlers-Danlos correlaciona-se com um aumento no diâmetro da fibrila para 110-140 nm, que normalmente é 90-100 nm (Kucharz, 1992). Além disso, o empacotamento periódico D regular das moléculas é interrompido nas fibrilas. Isto pode ser uma consequência da diminuição da síntese de fibronectina e proteoglicanos. Sabe-se que os proteoglicanos influenciam o empacotamento e o tamanho das fibras de colágeno. Na cultura de fibroblastos in vitro, foi encontrada uma diminuição na síntese de moléculas de colágeno tipo III, o que leva a uma alteração na proporção de colágenos tipo I e III na pele e, finalmente, a um aumento no diâmetro das fibrilas. A ausência de colágeno tipo III altera o empacotamento das fibrilas de tal forma que o diâmetro das fibrilas aumenta significativamente em comparação ao normal. A hiperextensibilidade da pele e dos ligamentos está associada à inibição da reticulação durante a formação das fibrilas devido à redução da atividade da lisil oxidase e, consequentemente, ao número reduzido de grupos aldeído nas moléculas. A formação de fibrilas a partir de moléculas de colágeno na presença de colágeno pN também é afetada pela atividade da N-peptidase do procolágeno. Com a atividade enzimática reduzida, o empacotamento das estruturas de colágeno é significativamente perturbado, o que leva ao aumento da extensibilidade dos ligamentos na escoliose e outras doenças do sistema músculo-esquelético. Os defeitos da síndrome de Marfan, que estão associados a anormalidades nos tecidos oculares, nos sistemas esquelético e cardiovascular, também são um exemplo de alterações no empacotamento das moléculas de colágeno. O aumento da extensibilidade do tecido está associado a um grau reduzido de reticulação, causado por alterações na estrutura das cadeias α2(1). Consequentemente, devido à ruptura do empacotamento das triplas hélices do colágeno, os contatos entre as cadeias laterais dos resíduos de aminoácidos nas fibrilas são enfraquecidos. A osteogênese imperfeita pertence a um grupo de doenças associadas a defeitos hereditários e distúrbios metabólicos. A doença mais comum é a osteoporose.

A doença hereditária osteoporose manifesta-se não apenas no aumento da fragilidade óssea, mas também no adelgaçamento da pele, esmalte dentário opalescente e esclera azulada. Os principais defeitos parecem estar associados ao colágeno tipo I. Sabe-se que as fibrilas ósseas consistem apenas em moléculas de colágeno tipo I. No entanto, em tecidos jovens, junto com o colágeno tipo I, o colágeno tipo V está presente em pequenas quantidades. é encontrado maior teor de colágeno tipo V em relação ao normal, assim como colágeno tipo III. As moléculas de colágeno tipo III e V podem se ligar às fibrilas na zona de hiato, onde o fosfato de cálcio está normalmente localizado, e assim podem alterar o empacotamento das moléculas de colágeno tipo I nos ossos. Na osteoporose, foram encontradas mutações em genes que codificam certos aminoácidos, como a glicina (Baum e Brodsky, 1999). Conseqüentemente, a sequência regular de trigêmeos e o empacotamento das moléculas nas fibrilas mudam. Também foram descobertas mutações em genes, levando à remoção de blocos inteiros de aminoácidos, o que leva ao encurtamento das cadeias a e a alterações no empacotamento de moléculas e fibrilas. Além disso, na osteoporose, observa-se diminuição da síntese de cadeias pró-a1(I). Como resultado, o empacotamento da tripla hélice do colágeno é interrompido, o que posteriormente altera o empacotamento das fibrilas. As formas não hereditárias de osteoporose parecem estar associadas a alterações no grau de hidroxilação da lisina nas moléculas de colágeno. A diminuição da hidroxilação da lisina ocorre quando a concentração de Ca no corpo é baixa, o que se correlaciona com a deficiência de vitamina D (Krane, 1984). Um aumento no grau de hidroxilação da lisina pode ocorrer quando a taxa de transporte de cadeias pró-a através do retículo endoplasmático é reduzida ou durante o processo de exocitose de moléculas de pró-colágeno da célula. Na osteoporose letal, níveis aumentados de hidroxilação da lisina correlacionam-se com um diâmetro de fibrila anormalmente baixo (Gay e Miller, 1978). Aparentemente, um aumento na destruição do colágeno intracelular com redução da secreção de moléculas leva a baixas concentrações de colágeno no espaço extracelular, o que altera significativamente o empacotamento das fibrilas. Usando análise estrutural de raios X, foi demonstrado que nos tendões de galinhas com distrofia muscular, o grau de ordenação das fibrilas e fibras de colágeno é reduzido pela metade em comparação ao normal (Stinson, 1975). 2.7. Métodos para estudar estruturas ordenadas de colágeno. 2.7.1. Método de microscopia eletrônica. Grandes sucessos no estabelecimento da estrutura ordenada das fibrilas de colágeno estão associados ao uso da microscopia eletrônica e da análise de difração de raios X. Assim, imagens microscópicas eletrônicas de fibrilas de colágeno de diferentes tecidos conjuntivos revelaram as mesmas estrias transversais na direção longitudinal das fibrilas (Brodsky, Eikenbary, 1982). A região principal da estriação periódica D, igual a 64 nm, inclui bandas claras e escuras, divididas em subbandas. A estriação das fibrilas de colágeno está associada a diferentes graus de coloração de resíduos de aminoácidos polares e neutros na obtenção de amostras para estudos de microscopia eletrônica.

Para fibrilas de colágeno tipo I reconstituídas in vitro, a ligação de corantes a grupos carregados positiva e negativamente produziu 12 bandas por período D. A regularidade do período D de acordo com a microscopia eletrônica varia de 50 nm a 67 nm. A periodicidade nas fibrilas parece depender do tipo de tecido conjuntivo e da idade do animal. Scott e cols. em 1981 determinaram que em animais adultos a ligação do colágeno aos proteoglicanos nos tendões leva a uma periodicidade de 62 nm, e em animais jovens a uma diminuição da periodicidade para 50 nm. Nos recém-nascidos, a periodicidade é ainda menor e chega a 45 nm. Uma característica das fibrilas com periodicidade reduzida é o alto teor de sulfato de condroitina nos tecidos jovens. Também foi estabelecida uma alteração na periodicidade de até 53 nm nos tendões de coelho e de até 55 nm nas fibrilas de colágeno da córnea. O trabalho (Scott, 1988) mostra a ligação de proteoglicanos a fibrilas de tecidos jovens ao longo da superfície das fibrilas, bem como na zona de lacuna. A microscopia eletrônica determina não apenas a periodicidade do empacotamento das fibrilas, mas também registra a estrutura assimétrica das fibrilas, correspondendo à orientação do empacotamento das moléculas do terminal N para o terminal C (Kadler et al, 1996). Foi demonstrado que o crescimento axial das fibrilas nos tendões do embrião de galinha ocorre de forma desigual nas diferentes extremidades da fibrila. Imagens de microscopia eletrônica mostram extremidades pontiagudas e rombas assimétricas da fibrila, que são chamadas de extremidades a e p. Primeiro, o crescimento das fibrilas é observado na extremidade a, depois de algum tempo - na extremidade P. Foi demonstrado que ambas as extremidades da fibrila têm formato elipsoidal. Isto implica uma relação linear entre o aumento na massa da fibrila e a distância. O método de microscopia eletrônica, ao registrar o empacotamento D-periódico das moléculas, permite estabelecer a estrutura ordenada das fibrilas no sentido longitudinal. Porém, o empacotamento das moléculas no sentido transversal não é preservado, o que está associado à desidratação das amostras durante seu preparo para análise. Se compararmos as fibrilas por diâmetro, o método de microscopia eletrônica fornece valores de diâmetro 10-40% menores em comparação com o método de difração de raios X.

Liberação e purificação de colágeno

Para isolar e purificar proteínas de diferentes tecidos utilizamos os métodos propostos pelos autores dos trabalhos (Khilkin et al., 1976; Chandrakasan et al., 1976; Gelman et al., 1979; Veis et al., 1981) e modificado em nossos trabalhos. A pele do porco foi limpa de gordura e pêlos e cortada em pedaços medindo 5x5 mm. O tecido foi pré-tratado com solução de NaOH 2% em NaSOj 2,8% por 48 horas. O extrato foi centrifugado a 7.000 g por 20 min. O sobrenadante foi descartado e o sedimento tratado com solução de ácido bórico a 2% até pH neutro. Em seguida, o precipitado foi lavado com água destilada e tratado com 10 vezes o volume de solução de ácido acético 0,5 M. A extração foi realizada por 72 horas. Para remover o material insolúvel, o homogeneizado foi passado duas vezes em peneira de náilon. A precipitação do colágeno foi realizada com álcool etílico resfriado até uma concentração final de álcool de 30%. Anteriormente, a solução de colágeno foi alcalinizada com uma solução de NaOH 1 M até pH 5,0. O extrato foi deixado por 12 horas e depois centrifugado a 7.000g por 20 minutos. O precipitado foi dissolvido numa solução de ácido acético 0,5 M. A parte insolúvel foi removida por centrifugação a 18.000 g durante 1 hora. O colágeno foi reprecipitado com álcool etílico resfriado até uma concentração final de álcool de 14%. O precipitado foi redissolvido num volume de 3 vezes de ácido acético 0,5 M e dialisado contra um volume de 40 vezes de solução de ácido acético 0 DM com 3-4 mudanças de solução. O dialisado foi centrifugado a 100.000g por 2 horas. O precipitado foi descartado e o sobrenadante foi utilizado para experimentos. Todos os procedimentos foram realizados a uma temperatura de 4-6ºC. 3.2.2. Colágeno de tendões de cauda de rato 3.2.2.1. Colágeno com telopeptídeos O colágeno foi obtido dos tendões da cauda de ratos brancos jovens. As caudas foram embebidas durante a noite em água destilada. Os tendões foram isolados da seguinte forma: foi feita uma incisão longitudinal na cauda, ​​​​a pele foi retirada e, a partir da ponta, a cauda foi quebrada em fragmentos e os tendões foram arrancados. Os tendões foram lavados em água destilada e tratados com 10 vezes o volume de solução de ácido acético 0,5 M. A extração foi realizada com agitação constante em agitador magnético por 72 horas, resultando em 3 extrações consecutivas, cada uma com duração de 24 horas. O 1º, 2º e 3º extratos foram combinados e filtrados através de diversas camadas de gaze. O extrato foi diluído com solução de ácido acético 0,5 M e centrifugado a 30.000 g por 2 horas. Os restos de tecido insolúveis foram descartados e o colágeno sobrenadante foi purificado 3 vezes.

A purificação do colágeno a partir de impurezas e agregados de alto peso molecular foi realizada utilizando soluções diluídas de colágeno com concentração de 1 m g/ml. O colágeno foi obtido por precipitação, seguida de centrifugação e redissolução em solução de ácido acético 0,5 M. A precipitação foi realizada com solução de NaCI a 30% até concentração final de NaCI a 5%, com agitação constante do extrato em agitador magnético e adição de solução de NaCI de bureta em pequenas porções. O extrato foi deixado por 12 horas. O sedimento de colágeno foi separado por centrifugação a 7.000 g por 1 hora. O colágeno foi redissolvido em solução de ácido acético 0,5 M por 12 horas. Em seguida, a diálise foi realizada durante 24 horas contra um volume de 40 vezes de uma solução de ácido acético 0,5 M com mudança de solução de 3-4 vezes. O dialisado foi centrifugado a 30.000g por 2 horas. A metade superior do sobrenadante foi utilizada para a 2ª purificação de acordo com o procedimento descrito acima. A metade inferior do sobrenadante com sedimento foi descartada. A 3ª precipitação do colágeno foi realizada com álcool etílico resfriado até concentração final de álcool de 14%. Anteriormente, a solução de colágeno foi alcalinizada com uma solução de NaOH 1 M até pH 5,0. A centrifugação e redissolução do colágeno foram realizadas como antes. A diálise foi realizada contra uma solução de ácido acético 0,1 M. A solução de colágeno dialisada foi centrifugada em ultracentrífuga a 160.000g por 2 horas. A metade superior do sobrenadante foi utilizada para experimentos. A metade inferior do sobrenadante com sedimento foi descartada. O extrato de colágeno obtido dos tendões da cauda de rato foi centrifugado a 30.000 g por 2 horas para remover material insolúvel e foi utilizado para obter colágeno sem telopeptídeos. O tratamento das moléculas de colágeno com pepsina foi realizado a uma temperatura de 25°C por 24 horas da seguinte forma: a pepsina foi adicionada a uma solução de colágeno de ácido acético 0,5 M com uma concentração de 1 mg/ml, pH 2,5 em uma proporção enzima/substrato de 1:10, e após 12 horas foi adicionada a mesma quantidade de pepsina. Em seguida, a pepsina foi inativada com uma solução de O, IN NaOH até pH 7,0 e o colágeno foi precipitado com álcool etílico resfriado até uma concentração final de álcool de 30%. O precipitado foi separado por centrifugação a 7.000 g durante 1 hora. O sobrenadante foi descartado, o sedimento de colágeno foi ressuspenso e redissolvido em solução de ácido acético 0,5 M em agitador magnético. Para remover impurezas de telopeptídeos e pepsina, foi realizada uma segunda precipitação de colágeno, seguida de centrifugação, redissolução em solução de ácido acético 0,5 M, diálise e ultracentrifugação de acordo com o método descrito anteriormente para purificação de colágeno tipo I. 3.3. Métodos de investigação 3.3.1. Eletroforese de amostras de colágeno A homogeneidade das moléculas de colágeno após isolamento e purificação, bem como a presença de diferentes tipos de colágeno, foram verificadas por eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de dodecilsulfato de sódio. O sistema de eletroforese padrão proposto por Lammli (Lammli, 1970) e modificado em nosso trabalho foi utilizado neste trabalho. A proteína estava em uma solução de Na2HP04 0,02 M, NaCl 0,15, pH 6,0. Amostras de colágeno foram dissolvidas em Tris-HCl 50 tM, pH 7,5 com SDS a 0,5% e aquecidas por 5 min. Usamos géis concentradores de 3% e géis de separação de 5%. As proteínas foram coradas com Coomassie R-250 a 0,1% num sistema metanol-ácido acético-água. A fosforilase b foi utilizada como proteínas marcadoras: monômero (97.400 Da), dímero (194.800 Da), trímero (292.000 Da), tetrâmero (389.600 Da). 3.3.2. Determinação da concentração de colágeno A concentração de colágeno foi determinada pelo peso seco da proteína (Kupke D.W., Dorrier T.E., 1978) e pelo método de Lowry modificado (Stoscheck, 1990). O colágeno em uma solução de ácido acético 0,1 M e em uma solução tampão fosfato de Na2HP04 0,02 M, NaCl 0,15 M, pH 7,2 foi seco a 105°C sob vácuo durante 4-5 dias. Foram utilizados frascos de vidro, onde os frascos controle foram preenchidos com solvente. A pesagem foi realizada com precisão de ±0,1 mg. Ao usar o método Lowry, a proteína de calibração foi a gelatina. 3.3.3. Métodos ópticos. 3.3.3.1. Espectroscopia infravermelha.

A natureza nativa das moléculas de colágeno foi verificada por espectros de absorção na região infravermelha em um espectrômetro UR-20 (GDR). O espectro IR da tripla hélice do colágeno é caracterizado por uma série de bandas associadas às vibrações dos grupos amida e peptídico das cadeias a. O máximo da banda amida A está localizado em -3330 cm 1, e o máximo da banda amida I está localizado em 1665 cm 1. Amostras de filmes secos em substratos de quartzo foram utilizados para análise. Os substratos foram colocados em uma célula selada a uma temperatura constante. 3.3.3.2. Espectrofotômetro e I A presença de telopeptídeos foi verificada pelo espectro de absorção de tirosina na região ultravioleta distante em um espectrofotômetro Specord UV VIS (GDR). Nos espectros UV de absorção de moléculas de colágeno com telopeptídeos intactos em solução de Gu-HCl 6 M, Na2HP04 0,03 M, pH 6,5, a tirosina corresponde a um pico principal em 276 nm e um pico adicional em 282 nm (Na, 1988) . Foi utilizada uma concentração molecular de 20 mg/ml. A cinética de formação de fibrilas foi estudada por meio de alterações na turbidez das soluções de colágeno, bem como alterações na densidade óptica, dependendo dos parâmetros de automontagem das moléculas. As medições foram realizadas num espectrofotómetro Specord UV VIS (GDR) num comprimento de onda de 400 nm. Utilizamos cubetas de quartzo de 0,5 cm e 1 cm. Antes de encher a cubeta, a amostra foi desgaseificada. O controle de temperatura da amostra na cubeta foi realizado utilizando um termostato U 8 (Hungria). Para calibrar a temperatura foi utilizada uma resistência térmica semicondutora MT-54. A precisão da determinação da temperatura foi de ±0,G. A temperatura da amostra atingiu o valor desejado em 2 minutos. 3.3.3.3. Microscopia óptica de polarização A destruição de complexos de colágeno com condroitina-4-sulfato sob a ação da colagenase foi estudada usando microscopia óptica de polarização. Para a realização das medições foi utilizado um termomicroscópio BOETIUS RNMK-05 (GDR). O termomicroscópio inclui uma mesa de aquecimento de pequeno porte, um dispositivo de polarização integrado e um dispositivo de observação. A amostra de teste é colocada entre polares cruzados.

Efeito da temperatura e concentração de moléculas de colágeno na cinética de formação de fibrilas

Os resultados obtidos nas curvas cinéticas (Fig. 9) mostram que a duração da fase lag depende tanto da concentração de colágeno quanto da temperatura. Aumentar a concentração de 0,3 mg/ml para 1,2 mg/ml (quatro vezes) reduz a duração da fase lag pela metade, o que corresponde a um aumento no número de contatos entre as moléculas de colágeno e facilita o início da automontagem (Prata e Burk, 1983). A duração da fase de latência em T=30C comparada com a duração da fase de latência em T=25C é reduzida em cinco vezes. A dependência descoberta da temperatura da fase lag é determinada por mudanças conformacionais nas moléculas de colágeno (Crabtree e Fujimori, 1980; Helseth e Veis, 1981). Com o aumento da temperatura durante a fase de latência, o início da formação de microfibrilas ou o crescimento de microfibrilas em fibrilas intermediárias - subfibrilas pode ser acelerado (Silver e Birk, 1983). O trabalho (Suarez et al, 1985) mostrou que o aumento da temperatura de 25°C para 30°C leva a um aumento na taxa de formação de fibrilas e no número de subfibrilas na fase de latência. Em temperaturas fisiológicas, é possível uma rápida mudança na conformação das moléculas, de modo que a automontagem das moléculas de colágeno ocorre sem fase de latência em T = 35C. Os dados da Tabela 4 mostram que em T = 30C o parâmetro bl aumenta quatro vezes, e em T = 35C aumenta oito vezes em comparação com o parâmetro t em T = 25C. Como foi estabelecida uma alteração regular nos valores de L/g em todas as concentrações de colágeno estudadas (0,3, 0,6 e 1,2 mg/ml), podemos concluir que, a partir de T = 30C, a taxa de formação de fibrilas de colágeno aumenta significativamente. A T=35C e uma concentração de colágeno de 1,2 mg/ml, a formação de fibrilas de colágeno ocorre na velocidade mais alta (parâmetro b/g - 2 min.). O tempo para a formação de uma estrutura fibrilar estável, determinado pelo parâmetro tp, diminui três vezes com o aumento da temperatura de 25C para 35C. Estes estudos mostram que a temperatura e a concentração das moléculas de colágeno regulam a cinética do processo de fibrilogênese in vitro. Existe uma correlação conhecida entre a temperatura, a taxa de formação de fibrilas de colágeno e o diâmetro das fibrilas. Madeira et al. em 1960, foi determinado que um aumento na temperatura de 25C para 37C leva a um aumento na taxa de formação de fibrilas em 5-8 vezes e a uma diminuição no diâmetro das fibrilas em um fator de dois. Além disso, descobriu-se que em T = 20 C o diâmetro das fibrilas é de 200 nm, e em T = 34 C é de 20-70 nm (Kadler et al., 1996).

De acordo com nossos dados, em T = 25C, as fibrilas são formadas em baixa taxa e podem ter grande diâmetro. Mas em T=26C, medições microscópicas eletrônicas revelaram um empacotamento solto de fibrilas (Williams et al, 1978). A mudança no diâmetro foi previamente associada (Wood et al, 1960) a uma mudança no empacotamento das moléculas apenas na direção transversal das fibrilas. As moléculas de colágeno nas fibrilas em temperaturas fisiológicas (T=34C) passam por duas transições conformacionais: no final da fase de latência e também durante a fase de saturação (George, Veis, 1990). A mudança na conformação está associada à formação de uma estrutura super-helicoidal de fibrilas e ao ajuste mútuo das moléculas nas direções transversal e longitudinal das fibrilas. Segue-se disso que em T fisiológico = 35C, um empacotamento mais denso de fibrilas é possível. As alterações estruturais nas fibrilas de colágeno com variação de temperatura e concentração foram analisadas utilizando dados obtidos de curvas calorimétricas. As curvas de absorção de calor das fibrilas de colágeno são caracterizadas por picos assimétricos (Fig. 10). Com o aumento da temperatura de 25C para 35C, a intensidade do pico de transição e a nitidez do pico aumentam, o que caracteriza um aumento no grau de cooperatividade das fibrilas. A meia largura da transição AT aumenta duas vezes em concentrações de colágeno relativamente baixas (0,3-0,6 mg/ml) e uma vez e meia em uma concentração de colágeno relativamente alta (1,2 mg/ml), se compararmos os valores de DT em T=25C e T=35C. A estabilidade térmica das fibrilas diminui em 1,5°C com o aumento da temperatura de 25°C para 35°C. Aumentar a concentração quatro vezes não afeta a estabilidade térmica das fibrilas. Os resultados foram obtidos sobre o valor máximo de entropia e entalpia das fibrilas formadas à temperatura de 30°C (Tabela 5). O trabalho (Na et al, 1989) descobriu que com o aumento da temperatura de 12C para 27,5C, o valor da entalpia aumenta. No entanto, Cooper em 1970 determinou que a formação de fibrilas com o aumento da temperatura de 20C a 37C é acompanhada por uma diminuição consistente na entropia e na entalpia. Segundo nossos dados, um aumento na temperatura de 25C para 30C leva a um aumento da entropia e, conseqüentemente, a fibrilas desordenadas. Um aumento na temperatura de 30C para 35C leva a uma diminuição da entropia, o que caracteriza a formação de uma estrutura fibrilar ordenada. A queda na entropia é compensada por uma queda na energia devido à formação de contatos entre as moléculas de colágeno que se aproximam. Quando a ligação das moléculas de proteína ocorre rapidamente (seg., min.), a queda na entropia é rapidamente compensada pela queda na energia. Sob tais condições, o processo de automontagem de moléculas não é bloqueado por uma barreira de alta energia livre (Finkelstein, Ptitsyn, 2002). A uma temperatura fisiológica de 35ºC, a formação de fibrilas ocorre rapidamente em todas as concentrações estudadas de moléculas de colágeno (min.) e é acompanhada por valores mínimos de entropia e entalpia. Aparentemente, em temperaturas de 250C, 30C e 35C, as fibrilas de colágeno são formadas de diferentes maneiras devido às moléculas monoméricas de colágeno ligadas e não ligadas às fibrilas. Sabe-se que o número de moléculas de colágeno ligadas às fibrilas in vitro é influenciado pelas condições de fibrilogênese (Cooper, 1970; Na, 1989). Segundo Cooper, em T=30C o número de moléculas ligadas é máximo, em T=25C seu número é menor e em T=35C ainda menor. A entalpia total das fibrilas consiste na entalpia das moléculas de colágeno e na entalpia de formação das fibrilas. Os resultados da entalpia indicam que a entalpia total pode ser modificada pela contribuição da entalpia das moléculas de colágeno não ligadas.

Com base no valor da entalpia é possível estimar o conteúdo relativo de ligações não covalentes nas macromoléculas (Edsol, 1986). Para analisar o processo de fibrilogênese in vitro, é importante avaliar a contribuição das ligações intermoleculares formadas. Conhecendo a entalpia de desnaturação das moléculas de colágeno, é possível determinar a entalpia de formação de fibrilas AHf (Tiktopulo et al, 1998). Os valores de AHf indicam (Tabela 5) que o número de ligações intermoleculares fracas aumenta com o aumento da temperatura de 25C para 30C e diminui com o aumento da temperatura de 30C para 35C. Se compararmos o efeito das temperaturas de 30°C e 35°C na fibrilogênese do colágeno dependendo da concentração, deve-se notar que o número de ligações intermoleculares diminui pela metade a uma temperatura de 35°C e uma concentração de 1,2 mg/ml. Sob condições fisiológicas de pH, força iônica e temperatura, a estrutura ordenada das fibrilas é formada devido à diminuição do número de ligações intermoleculares fracas e ao empacotamento mais denso de moléculas nas fibrilas. A compactação das moléculas de colágeno ou o grau de sua cooperatividade nas fibrilas foi avaliada pelo número de sítios cooperativos formando um único sistema cooperativo. O número de sítios cooperativos nas moléculas de colágeno, l, desde que as unidades estruturais fundam independentemente, é calculado pela fórmula (Lumry et al., 1966): n=DN-M D774D-Gt2, (1) onde M é o molecular peso de colágeno; R - constante do gás; D// é o calor de transição do estado nativo para o estado desordenado, calculado por grama de proteína; Tt é a temperatura de transição do estado nativo para o estado desordenado; DT é a meia largura da transição do estado nativo para o estado desordenado. A uma temperatura fisiológica de 35ºC, a formação de fibrilas ocorre rapidamente em todas as concentrações estudadas de moléculas de colágeno (min.) e é acompanhada por valores mínimos de entropia e entalpia. Aparentemente, em temperaturas de 250C, 30C e 35C, as fibrilas de colágeno são formadas de diferentes maneiras devido às moléculas monoméricas de colágeno ligadas e não ligadas às fibrilas. Sabe-se que o número de moléculas de colágeno ligadas às fibrilas in vitro é influenciado pelas condições de fibrilogênese (Cooper, 1970; Na, 1989). Segundo Cooper, em T=30C o número de moléculas ligadas é máximo, em T=25C seu número é menor e em T=35C ainda menor. A entalpia total das fibrilas consiste na entalpia das moléculas de colágeno e na entalpia de formação das fibrilas. Os resultados da entalpia indicam que a entalpia total pode ser modificada pela contribuição da entalpia das moléculas de colágeno não ligadas.

Fibra de fibra)

unidades estruturais de fibra de colágeno que consistem em proteína de colágeno.

1. Pequena enciclopédia médica. - M.: Enciclopédia Médica. 1991-96 2. Primeiros socorros. - M.: Grande Enciclopédia Russa. 1994 3. Dicionário Enciclopédico de Termos Médicos. - M.: Enciclopédia Soviética. - 1982-1984.

Veja o que são “fibrilas de colágeno” em outros dicionários:

- (fibrillae colagenosae, LNH; lat. fibrilla, diminutivo de fibra de fibra) unidades estruturais de fibra de colágeno constituídas por proteína de colágeno ... Grande dicionário médico

- (t. prechondralis; lat. prae antes + grego. cartilagem condros; sin. T. protocondral) T. do embrião humano, consistindo de condroblastos e finas camadas de substância intercelular contendo fibrilas de colágeno; de T. p. cartilaginoso T é formado ... Grande dicionário médico

- (textus, LNH) um sistema de células e estruturas não celulares unidas por uma função, estrutura e (ou) origem comum. Tecido de granulação (granulationes; sinônimo: granulação, T. granular) T. conjuntivo, formado durante a cicatrização de defeitos teciduais ... Enciclopédia médica

Distrofia congênita do estroma corneano ... Wikipedia

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I Osso (os) é um órgão do sistema músculo-esquelético, construído principalmente a partir de tecido ósseo. A totalidade de células conectadas (continuamente ou continuamente) por tecido conjuntivo, cartilagem ou tecido ósseo forma o esqueleto. O número total de K. esqueleto... ... Enciclopédia médica

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O colágeno (do grego Kolla - cola, genes - dar à luz) une um grupo de proteínas fibrilares relacionadas do tecido conjuntivo, que representam 25 a 33% de todas as proteínas do corpo. Os colágenos são as principais glicoproteínas da pele, tendões, cartilagens, ligamentos, ossos, dentes e vasos sanguíneos.

O colágeno é a base das fibras de colágeno, que são coletadas em feixes de espessuras variadas e formam uma única estrutura de malha no tecido conjuntivo. As fibras de colágeno consistem em minúsculas fibrilas que possuem alta resistência mecânica e praticamente não se esticam. Eles apoiam a estrutura específica dos órgãos e tecidos durante o desenvolvimento e funcionamento do corpo.

O colágeno nativo é resistente a enzimas proteolíticas, ácidos e álcalis. Os resíduos de carboidratos localizados na superfície das fibrilas protegem o colágeno da ação das proteases, por isso é pouco absorvido pelo organismo. O colágeno é insolúvel em água, soluções salinas, solventes orgânicos e soluções fracas de ácidos e álcalis, pois 70% dos aminoácidos em sua composição são hidrofóbicos. O colágeno é capaz de inchar e sua massa aumenta de 1,5 a 2 vezes. A alta hidratação de uma molécula de proteína está associada à presença de um número significativo de grupos polares laterais em sua estrutura.

Propriedades mecânicas do colágeno associadas às suas estruturas primárias e espaciais. Uma característica da composição química é que cada terceiro aminoácido do colágeno é glicina, 1/3 são resíduos de prolina e hidroxiprolina, 1% é hidroxilisina, 10% é alanina, o restante são outros aminoácidos. Falta cisteína e triptofano; histidina, metionina e tirosina estão contidas em pequenas quantidades. O colágeno é a única proteína que contém hidroxiprolina. As cadeias peptídicas de proteínas são construídas a partir de um “tripleto”, em que um dos aminoácidos é a glicina.

As posições X e Y podem conter qualquer aminoácido, mais frequentemente X prolina, B hidroxiprolina ou hidroxilisina. Esses grupos de aminoácidos são repetidos muitas vezes na cadeia. Uma molécula de proteína contém cerca de 1000 resíduos de aminoácidos. Cada corrente forma uma espiral torcida. Mais de 20 tipos de αlanzygives foram identificados, que diferem na sequência de aminoácidos. O passo de uma volta da hélice consiste em menos de 3 resíduos de aminoácidos, em vez de 3,6 por volta, como na maioria das proteínas. O empacotamento próximo da hélice se deve à presença de glicina. A prolina não forma ligações de hidrogênio, portanto a hélice da cadeia peptídica do colágeno é estabilizada pela repulsão estérica dos anéis de pirrolidina nos resíduos de prolina. Graças à prolina, aparecem curvas na cadeia polipeptídica, que estabilizam a estrutura da hélice. A distância entre os aminoácidos ao longo do eixo da hélice aumenta, torna-se mais desdobrada do que a hélice α das proteínas globulares.

As moléculas de colágeno consistem em três polipeptídeos α-lancs, formando uma hélice tripla destra de tropocolágeno. Os colágenos podem conter três cadeias idênticas ou diferentes. Todas as três espirais são torcidas uma em torno da outra, formando um feixe denso34).

A estrutura terciária do colágeno é mantida por ligações de hidrogênio que surgem entre os grupos amino e carboxila de diferentes cadeias peptídicas (C = O HN) e ligações de hidrogênio dentro de cada polipeptídeo (Fig. 35).

Todas as três cadeias da molécula de colágeno estão localizadas em paralelo - de um lado está Nkinets, do outro - Skinets, todos os radicais de aminoácidos hidrofóbicos estão localizados para fora.

A prolina e a hidroxiprolina limitam a rotação da cadeia polipeptídica e aumentam a estabilidade da tripla hélice. A glicina, que possui um átomo de hidrogênio em vez de um radical, está sempre localizada na intersecção das cadeias, o que permite que elas se encaixem perfeitamente.

Por sua natureza, o colágeno é uma glicoproteína contendo resíduos de monossacarídeo (galactosil) e dissacarídeo (galactosglucosil) ligados à oxilisina. Devido à agregação de moléculas de tropocolágeno nas direções longitudinal e transversal, forma-se a estrutura quaternária do colágeno - microfibrilas, a partir das quais se formam fibrilas mais espessas, e a partir delas fibras e feixes de fibras. As moléculas de colágeno são formadas em fibrilas por ligações covalentes formadas por resíduos de oxilisina.

Atualmente, foram descritos 28 tipos de colágenos, que diferem entre si na estrutura primária, grau de modificação - hidroxilação ou glicosilação, funções e localização no corpo. Os colágenos são divididos em várias classes dependendo de seu papel no tecido: domínios formadores de fibrilas, associados a fibrilas, formadores de peneira, microfibrilas, ancorados em fibrilas, transmembrana e outros. Cerca de 95% do colágeno do corpo humano é representado pelo tipo III, que formam fibrilas fortes e são os principais componentes estruturais de tendões, cartilagens, vasos sanguíneos e outros, e também participam da formação do estroma dos órgãos parenquimatosos. Um ou outro tipo de colágeno pode predominar em um tecido. Vários tipos de colágeno são encontrados em órgãos individuais (Tabela 7).

A composição dos colágenos em órgãos individuais pode mudar durante a ontogênese ou devido a doenças.

Existem dois tipos de cadeias de colágeno, cadeias α1 e α2, e quatro variedades de cadeia α1: α1 (I), α1 (II), α1 (III) e α1 (IV). Para designar a estrutura de cada tipo de colágeno, são utilizadas as seguintes notações: o tipo de colágeno é escrito em algarismos romanos entre colchetes, os αlants são designados em algarismos arábicos. Por exemplo, os colágenos dos tipos II e III são formados por αlanzygams idênticos, suas fórmulas são [α1 (II)] 3 e [α1 (III)] 3, respectivamente; Os colágenos tipos I e IV são heterotrímeros, formados por dois tipos diferentes de αlanzygives, suas fórmulas são [α1 (I)] 2α2 (I) e [α1 (IV)] 2α2 (IV), respectivamente. O índice fora do colchete indica o número de αlancs idênticos. O colágeno tipo I mais comum.

Síntese de colágeno

A síntese de colágeno ocorre nas células, principalmente nos fibroblastos do tecido conjuntivo, de onde é secretado para o espaço extracelular.

Existem estágios intracelulares e extracelulares de biossíntese de colágeno, contendo os seguintes estágios:

- transmissão;

— modificação pós-tradução de cadeias peptídicas:

— hidroxilação de prolina e lisina;

— proteólise parcial — clivagem do peptídeo sinal

- glicosilação de hidroxilisina;

— formação de ligações SS no propeptídeo final;

— formação de uma tripla hélice;

— transferência transmembrana;

- modificações extracelulares - clivagem do propeptídeo N e Scintsev;

- formação de fibrilas de colágeno:

— desaminação oxidativa de resíduos de lisina e oxilisina;

— formação de ligações cruzadas entre moléculas de colágeno;

- formação de fibras de colágeno.

1. Síntese de pré-procolágeno. A síntese de precursores polipeptídicos – prolancinas de colágeno – ocorre em polirribossomos associados às membranas do retículo endoplasmático (RE). No Nkinci do precursor do colágeno existe um peptídeo “sinal” hidrofóbico de 100 aminoácidos. Ele é projetado para direcionar cadeias peptídicas sintetizadas na cavidade do RE. O colágeno proαlanzyg contém N adicional e propeptídeo Skintsevi, consistindo em 100 e 250 aminoácidos, respectivamente.

A composição do propeptídeoC inclui resíduos de cisteína, que formam ligações SS internas e intermediárias. Os propeptídeos terminais não participam da formação da tripla hélice, mas formam domínios globulares. A ausência dos peptídeos N e Skints na estrutura do proαlanzyug atrapalha a formação correta da tripla hélice.

Modificações pós-tradução do colágeno

A. Hidroxilação de resíduos de prolina e lisina

ocorre simultaneamente com a síntese de colágeno e continua ao longo de toda a tradução até a separação da cadeia polipeptídica dos ribossomos

nós37). A reação é catalisada por oxigenases microssomais – prolil4hidroxilase e lisil5hidroxilase, respectivamente. A reação envolve: oxigênio molecular, α-cetoglutarato e ácido ascórbico.

Um átomo de oxigênio é utilizado para a hidroxilação dos resíduos de prolina e lisina, o segundo está “incluído” no grupo carboxila do succinato, que se deve à descarboxilação do αcetoglutarato. O cofator da prolil4hidroxilase e da lisil5hidroxilase é Fe++. O ácido ascórbico, que possui propriedades redutoras, preserva os átomos de ferro em estado divalente (ferofórmio) e, assim, mantém a atividade enzimática). A forma oxidada da vitamina C - ácido desidroascórbico - é novamente reduzida pela glutationa:

Após a formação da tripla hélice, a hidroxilação dos resíduos de prolina e lisina é interrompida. A hidroxilação de resíduos de prolina é importante para a subsequente formação de uma tripla hélice estável de colágeno devido às ligações de hidrogênio formadas pelo grupo OH da hidroxiprolina. Resíduos de lisina hidroxilados e não hidroxilados estão envolvidos na formação de ligações covalentes entre moléculas de colágeno durante a formação de fibrilas de colágeno.

B. Glicosilação de hidroxilisina. A cadeia de procolágeno, com a ajuda do peptídeo sinal N-kin, penetra através da membrana na cavidade do RE. Depois de cumprir sua função, o peptídeo sinal é clivado. Na cavidade do RE, os resíduos de hidroxilisina nos prolanos de colágeno são glicosilados com a participação de glicosiltransferases específicas.

A galactose e o dissacarídeo galactosilglicose formam ligações glicosídicas covalentes com os grupos SO dos resíduos de hidroxilisina .

O número de resíduos de carboidratos na molécula depende do tipo de tecido; seu papel não foi estabelecido. Eles podem ser responsáveis ​​pelas propriedades mecânicas do colágeno. A glicosilação do colágeno proαlanzigina é concluída após a formação da tripla hélice.

Síntese e secreção de procolágeno. Após a modificação, cada proαlanjug é ligado por hidrogênio a dois outros proαlanzyugs, formando uma hélice tripla de procolágeno. Os propeptídeos finais desempenham um papel importante na orientação correta das cadeias. A helicalização dos filamentos de procolágeno começa após a formação de pontes dissulfeto intercadeias entre as cadeias propeptídicas Skintsevima devido ao grupo SH da cisteína. Esse processo começa no lúmen do RE, de onde as moléculas de prócolágeno se movem para o aparelho de Golgi, são incluídas nos grânulos secretores e são liberadas no espaço intercelular.

Síntese de tropocolágeno (colágeno solúvel). No espaço intercelular, sob a ação de amino e carboxipeptidases específicas, os propeptídeos finais são clivados do procolágeno (colágenos tipos I, II e III), resultando na formação do tropocolágeno - unidade estrutural das fibrilas de colágeno36). Nos colágenos que não participam da formação de fibrilas (IV, VIII, X), o propeptídeo final NÃO é clivado. Esses colágenos formam uma estrutura semelhante a uma rede, na formação da qual o N e os peptídeos finais desempenham um papel importante.

5. A formação de fibrilas de colágeno ocorre de forma espontânea, por automontagem. As fileiras de moléculas de tropocolágeno nas fibrilas são dispostas em paralelo e deslocadas ¼ umas em relação às outras. Em uma fileira, as moléculas são colocadas ponta a ponta, mas as pontas não estão conectadas, há lacunas de 35 a 40 nm entre elas.

Esta estrutura fibrilar é frágil (“colágeno imaturo”), sua força é conferida por ligações cruzadas covalentes internas e intermediárias formadas entre resíduos de lisina ou hidroxilisina com a participação de flavoproteínas contendo Cu - lisil oxidase. A desaminação oxidativa de grupos εamino ocorre em resíduos de lisina e hidroxilisina com a formação de grupos aldeído (alisina e hidroxilisina). Esses grupos participam da formação de ligações covalentes entre eles e outros resíduos de lisina e hidroxilisina de moléculas vizinhas de tropocolágeno.

Numerosas ligações cruzadas formadas estabilizam a estrutura da fibrila e o colágeno insolúvel é formado. O número de ligações cruzadas numa molécula de proteína aumenta com a idade, o que retarda o seu catabolismo. Alguns tipos de colágeno não formam fibrilas.

6. A formação de fibras colágenas ocorre por agregação de fibrilas36). Possuem alta resistência mecânica e formam uma malha tridimensional, que é preenchida com outras substâncias da matriz intercelular.

O catabolismo do colágeno ocorre lentamente. As enzimas proteolíticas nos tecidos e no trato gastrointestinal NÃO o decompõem. A destruição do colágeno é causada por espécies reativas de oxigênio e colagenases teciduais específicas). A enzima é sintetizada por células do tecido conjuntivo e possui alta especificidade). A colagenase “corta” a tripla hélice do colágeno (3 cadeias ao mesmo tempo) a uma distância de ¼ de Skints, entre os resíduos de glicina e leucina (isoleucina).

Os fragmentos formados são solúveis em água à temperatura corporal, desnaturam-se espontaneamente e tornam-se acessíveis à ação de proteases celulares (catepsinas).

A regulação do metabolismo do colágeno ocorre através de vários mecanismos:

Feedback negativo. Colágeno e Npropeptídeos inibem a tradução do colágeno.

Ação de ativadores e inibidores:

 o ácido ascórbico estimula a síntese de colágeno e proteoglicanos, proliferação de fibroblastos;

 vitaminas PP, B6, íons Cu++ contribuem para a “maturação” do colágeno (formação de ligações cruzadas covalentes internas e intercadeias;

 plasmina, calicreína, catepsina B, íons Zn - ativadores da colagenase, ou seja, promover a hidrólise do colágeno.

Regulação hormonal:

- inibir a síntese de colágeno no nível da tradução (reduzir a quantidade de mRNA que codifica a estrutura do procolágeno);

- inibir a modificação pós-tradução do procolágeno (hidroxilação de resíduos de prolina e lisina), reduzindo a atividade da prolil lisil hidroxilase).

Hormônios sexuais:

- ativar a síntese de colágeno. Os receptores dos hormônios sexuais estão localizados no estroma dos órgãos genitais, fibroblastos de outros órgãos e tecidos;

- Os estrogênios promovem a síntese de colágeno na pele.

A síntese de colágeno aumenta durante a cicatrização de feridas, cirrose hepática, aterosclerose, distrofias musculares, como resultado da formação de uma cicatriz de tecido conjuntivo no local da ferida, hepatócitos mortos, células da parede vascular, miócitos são substituídos por tecido conjuntivo no qual estão localizadas fibrilas de colágeno caoticamente.

A taxa de renovação do colágeno diminui com a idade. Nos jovens é mais intenso do que nos idosos. O número de ligações cruzadas no colágeno dos idosos é significativamente maior, o que reduz sua disponibilidade para a ação da colagenase.

Os distúrbios do metabolismo do colágeno (colagenose) ocorrem devido a:

Mutações genéticas que levam a alterações na estrutura nativa da tripla hélice ou formação inadequada de fibrilas de colágeno;

Comprometimento de modificações proteicas pós-tradução devido à diminuição da atividade enzimática:

Hidroxilação (prolina, lisina hidroxilase);

Glicosilação (glicosiltransferases);

Peptidase (Nprocolagênica e Esprocolagênica);

“maturação” do colágeno (lisil oxidase);

Deficiência de vitaminas C, B6, cobre;

Doenças infecciosas e alérgicas.

As manifestações características da colagenose são danos aos ossos, articulações, ligamentos, cartilagens, pele, vasos sanguíneos e o desenvolvimento de miopatia. A síntese prejudicada de colágeno é a causa de doenças como síndrome de Ehlers-Danlos, doença de Marfan, osteogênese imperfeita, reumatismo, artrite reumatóide, lúpus eritematoso sistêmico, esclerodermia sistêmica e outras.

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O colágeno (do grego kolla - cola e -genes - dar à luz, nascer) é uma proteína fibrilar que forma a base do tecido conjuntivo e garante sua força. O colágeno também é encontrado no tecido muscular. O colágeno ou tropocolágeno é a proteína mais abundante no reino animal; nos mamíferos, no corpo adulto, representa quase 30% da massa total de proteínas.

A estrutura do colágeno

A molécula de colágeno (peso molecular cerca de 300 mil, comprimento 300 nm, espessura 1,5 nm) tem uma estrutura semelhante a um bastão e consiste em três chamadas cadeias (peso molecular cerca de 100 mil), formando uma hélice tripla destra em tal forma que uma volta da cadeia helicoidal contém três resíduos de aminoácidos. As três cadeias, por sua vez, combinam-se em uma estrutura que é ligeiramente torcida em uma hélice destra. A Figura 11 mostra um modelo estrutural de colágeno na forma de três cadeias polipeptídicas separadas. Essas três cadeias polipeptídicas, dobradas em uma hélice esquerda, estão entrelaçadas em uma super ou superhélice direita. O colágeno é uma das poucas proteínas animais que contém resíduos de 3 e 4-hidroxiprolina (HO-Pro), bem como 5-hidroxilisina (HO-Lys); eles representam cerca de 21% de todos os resíduos de aminoácidos.

Tabela 3. Conteúdo de aminoácidos no colágeno, %.

Aminoácido
Aminoácidos não essenciais
Cisteína + cistina
Ácido aspártico
Ácido glutâmico
Aminoácidos essenciais
Fenilalanina
Triptofano
Isoleucina
Metionina
Histidina
Soma de todos os aminoácidos

A tabela mostra que a soma de todos os aminoácidos que compõem o colágeno é 100%. Desse montante, os aminoácidos não essenciais respondem por 72,6% e os aminoácidos essenciais respondem por 27,4%.

A tabela mostra ainda que o teor de aminoácidos não essenciais é 45,2% superior ao dos aminoácidos essenciais que compõem o colágeno.

Também está claro que a glicina representa 26% do conteúdo de aminoácidos não essenciais. O conteúdo de prolina é 10,9% menor que o de glicina; o teor de ácido glutâmico é 14,7% menor, o teor de alanina é 16,5% menor e o teor de tirosina, serina e ácido aspártico é insignificante em comparação com o teor de glicina.

Da tabela podemos concluir que o colágeno é caracterizado por uma grande quantidade de glicina, prolina e ácido glutâmico.

Uma característica única do colágeno é uma sequência repetida repetidamente nas cadeias de tripletos de aminoácidos glicina-XY (resíduo X, Y de qualquer aminoácido, exceto glicina), o que cria uma base conformacional para a helicalização da cadeia. A sequência tripla representa cerca de 90% de toda a cadeia e está localizada em sua parte central; as seções terminais são representadas por sequências não helicoidais (que não contêm um resíduo de glicina a cada 2 aminoácidos) (os chamados telopeptídeos). Foram descritos 5 tipos principais e cerca de 10 tipos “menores” de colágeno, diferindo em estrutura primária correntes. O colágeno é uma glicoproteína e, dependendo da fonte, contém de 2 a 80 resíduos de carboidratos por 1.000 resíduos de aminoácidos (principalmente na forma de mono ou dissacarídeos) ligados por uma ligação O-glicosídica ao grupo HO-Lys. Os monossacarídeos são representados pela D-galactose, que está ligada a um resíduo de aminoácido por uma ligação glicosídica. Nos dissacarídeos, a D-glicose está ligada por uma ligação 1-2 à D-galactose. A estabilização da molécula de colágeno ocorre devido a interações eletrostáticas e hidrofóbicas, bem como hidrogênio e ligações cruzadas covalentes entre cadeias. As ligações de hidrogênio são formadas pelo grupo carbonila e pelos grupos NH da ligação peptídica ou HO - o grupo HO--Pro; conexões envolvendo H2O também são possíveis. Ligações covalentes entre cadeias (reticulações) são formadas como resultado da condensação aldólica de resíduos de ácido 2-amino-6-oxohexanóico ou 2-amino-5-hidroxi-6-oxohexanóico, que são formados respectivamente a partir de resíduos de lisina ou 5-hidroxilisina. A reticulação das cadeias de moléculas de colágeno vizinhas ocorre como resultado da formação de aldiminas através da interação de resíduos de ácido 6-oxohexanóico com o grupo NH 2 da lisina ou 5-hidroxilisina. O colágeno contém ligações cruzadas que ligam 3 ou 4 cadeias de moléculas vizinhas. O colágeno nativo é pouco solúvel em água a um pH de cerca de 7. Quando moderadamente aquecido em soluções aquosas, o colágeno desnatura com a quebra de ligações não covalentes - as cadeias se desfazem e “derretem” para formar gelatina. Após a renaturação, as cadeias podem formar dímeros (partículas) ou trímeros (partículas G), que podem formar uma hélice. O precursor intracelular do colágeno no corpo é o procolágeno (sintetizado principalmente em fibroblastos), cujas moléculas consistem em três pró-cadeias com peso molecular de 140-180 mil. Essas cadeias contêm sequências globulares (não helicoidais) (chamadas propeptídeos) nas regiões N e C-terminais, que são clivadas durante a “maturação” extracelular do colágeno. As ligações intercadeias S-S estão localizadas nos propeptídeos C-terminais, estabilizando as moléculas de procolágeno.

Figura 11.

estrutura terciária, 2-molécula de tropocolágeno, 3-fibra de colágeno.

Características químicas do colágeno: especificamente alto teor de hidroxiprolina e oxilisina; alto teor de glicina, prolina, quantidade muito pequena de aminoácidos aromáticos; no estado nativo é digerido pela colagenase e não é digerido por outras proteases; tem propriedades histológicas específicas.

Físico - características químicas: dissolve-se em água quente após tratamento com ácidos ou álcalis na forma de gelatina ou cola, que são precipitados pelos tanantes; não se dissolve em água fria.

Propriedades físicas: padrão microscópico eletrônico específico de estriação transversal; birrefringência de fibras; radiografias específicas em grandes e pequenos ângulos.

A estrutura das fibrilas de colágeno muda gradualmente. O número de ligações de hidrogênio e éter entre as moléculas de tropocolágeno aumenta, as fibrilas engrossam (seu diâmetro aumenta de 500 para 600 A), com isso a proporção relativa da substância principal diminui. O mecanismo de dano ao aparelho valvar do coração durante o desenvolvimento do reumatismo é semelhante a este.

Se no corpo de uma criança a proporção hexosamina/hidroxiprolina for tendenciosa em favor da hexosamina, então, com a idade, essa proporção muda gradualmente na direção oposta.

A substância de base de ligação diminui e, em troca, as fibras de colágeno ficam mais espessas, a proporção entre a reticulina e as fibras de colágeno muda.

Tudo isso leva a mudanças significativas nas propriedades reológicas do tecido conjuntivo.

Uma porcentagem relativamente maior de fibroblastos no CT, ou seja, elementos biologicamente ativos na MO de organismos infantis e em crescimento, determina um metabolismo mais intenso e, ao mesmo tempo, maior vulnerabilidade sob a influência de diversos agentes nocivos.

“Reumatismo na infância”, Stefan Kolarov

A localização da prolina na estrutura primária do colágeno é determinada pelo DNA e, portanto, é transmitida pelo RNA mensageiro. O processo de formação da hidroxiprolina ainda não é totalmente compreendido. Os polipeptídeos sintetizados intracelularmente amadurecem fora da célula e formam fibrilas e fibras de colágeno. No entanto, as estrias transversais do colágeno já são visíveis na fase de sua formação no interior das células. No processo de seu isolamento, o colágeno passa pelas seguintes etapas:...

Os ativadores do plasminogênio ativam o plasminogênio, convertendo-o em plasmina. Deve-se enfatizar que o efeito proteolítico da plasmina não se aplica apenas ao fibrinogênio e à fibrina, mas também a uma série de outras proteínas. Aceite no passado, a especificidade deve-se à degradação mais rápida do fibrinogénio. Acredita-se que o plasminogênio seja ativado por essa peptidase, que cliva diversas ligações peptídicas. A presença de fibrinoquinases teciduais foi comprovada em vários órgãos e tecidos -...

Elementos estruturais da substância de colágeno A fibrila de colágeno insolúvel assim criada é a principal unidade constituinte do colágeno. A estrutura primária do colágeno (a sequência de aminoácidos em uma molécula de proteína) é determinada principalmente pelo tripéptido glicil-prolil-hidroxiprolina de repetição frequente, que é decisivo para as estruturas secundárias e terciárias. A estrutura secundária do colágeno é determinada pelo arranjo espacial dos 1000 aminoácidos constituintes, que conferem à cadeia polipeptídica um caráter espiral. Dois...

Conexões em ponte que aumentam a estabilidade das fibrilas de colágeno Designações: a - intracadeia e intramolecular, proporcionando conexão longitudinal; b - intercadeias e intramoleculares, proporcionando reticulação; c - intercadeias, intermoleculares, proporcionando reticulação. Uma característica é a localização de resíduos de glicina nas cadeias laterais dentro da molécula de colágeno, bem como de prolina, hidroxiprolina e outros resíduos de aminoácidos em seu lado externo...

Diagrama estrutural da fibra de colágeno (de acordo com Reed) Em essência, a sequência de distribuição das moléculas durante a formação das fibrilas é determinada em última análise pela sequência de aminoácidos alcalinos (básicos) e ácidos na molécula de colágeno, ou seja, em sua estrutura primária . A combinação de fibrilas individuais em feixes maiores antes da separação das fibras colágenas é provavelmente realizada com a participação de mucopolissacarídeos ácidos (glicose-noglicanos). A formação de colágeno ocorre...