Введение

1. Введение 5

2. Обзор литературы 8

2.1. Особенности строения молекул коллагена и их свойства, определяющие образование упорядоченных макромолекулярных структур 8

2.2. Структура коллагеновых фибрилл 11

2.3. Упаковка молекул в фибриллах, существующие модели 12

2.3.1. Упаковка молекул в продольном направлении фибрилл 12

2.3.2. Упаковка молекул в поперечном направлении фибрилл 15

2.4. Образование коллагеновых фибрилл in vivo 19

2.5. Фибриллогенез коллагена in vitro. Факторы и параметры, влияющие на самосборку молекул in vitro: температура, рН, ионная сила, концентрация молекул, компоненты внеклеточного матрикса 29

2.5.1. Состав ионов 31

2.5.2. Ионная сила 32

2.5.4. Температура 32

2.5.5. Концентрация 36

2.5.6. Компоненты внеклеточного матрикса 37

2.5.6.1. Гликозаминогликаны 38

2.6. Нарушения в упаковке коллагеновых молекул, приводящие к болезням и дефектам соеденительных тканей 42

2.7.Методы исследования коллагеновых фибрилл 44

2.7.1. Метод электронной микроскопии 44

2.7.2. Метод рентгеновской днффракции 46

2.7.3. Метод поляризационной микроскопии 48

2.8. Метод калориметрии 49

3. Материалы и методы исследования. .54

3.1. Материалы и реактивы 54

3.1.1. Объекты исследования. 54

3.1.2. Реактивы.. 54

3.2. Выделение коллагена и очистка 54

3.2.1. Коллаген из кожи свиней 55

3.2.2. Коллаген из сухожилий хвостов крыс 55

3.2.2.1. Коллаген с телопептидами 55

3.2.2.2. Коллаген без телопептидов. 57

3.3. Методы исследования 57

3.3.1. Электрофорез коллагеновых образцов 57

3.3.2. Определение концентрации коллагена 58

3,З.З.Оптические методы 58

3.3.3.1.Инфракрасная спектроскопия 58

3.3.3.2. Спектрофотометрия 58

3.3.3.3. Поляризационно-оптическая микроскопия 59

3.3.4, Метод сканирующей калориметрии 60

3.3.5. Методы электронной микроскопии 61

3.3.5.1. Метод сканирующей электронной микроскопии 61

3.3.5.2. Метод негативного контрастирования 61

3.4. Формирование коллагеновых фибрилл 62

3.4.1. Определение физико-химических характеристик коллагеновых молекул 62

3.4.2.0птимизация начальных условий фибриллогенеза коллагена w 63

3.4.2.1.Выбор методов образования нативных коллагеновых фибрилл 63

3.4.2.2. Выбор кинетического режима для самосборки молекул при температуре 4С с изменением температуры до 25С, 30С, 35С 65

3.4.2.3. Выбор начальных условий образования комплексов коллагена с молекулами внеклеточного матрикса 65

3.4.3. Поиск условий образования фибрилл: выбор фиксированных и варьируемых параметров. 65

4. Результаты и их обсуждение 68

4.1. Влияние температуры на фибриллогенез коллагена типа I с удаленными телопептидами 68

4.2. Влияние температуры и концентрации коллагеновых молекул на кинетику образования фибрилл 72

4.3. Термодинамические характеристики коллагеновых фибрилл, при разных значениях температуры и концентрации коллагеновых молекул. 75

4.4. Образование комплексов коллагена с компонентом внеклеточного матрикса хондроитин-4-сульфатом в зависимости от ряда условий 83

Заключение.89

Введение к работе

Фибриллогенез коллагена in vivo представляет собой сложный, многоэтапный процесс. Сначала синтезируется предшественник коллагена -проколлаген. После отщепления ферментами пропептидов проколлаген превращается в коллаген и секретируется из клеток. Самосборка молекул коллагена в фибриллы происходит на поверхности клеток. Коллагеновые фибриллы собираются в волокна во внеклеточном пространстве.

Коллаген является основным структурным элементом внеклеточного матрикса. В настоящее время известно 26 генетически различных типов коллагена. Коллаген типа I входит в состав фибрилл и волокон большинства соединительных тканей. Нарушения в упаковке молекул коллагена типа I приводят к таким заболеваниям соединительных тканей, как остеопороз, сколиоз, синдром Элерса-Данлоса, синдром Марфана и др. Повышенная растяжимость кожи при синдроме Элерса-Данлоса коррелирует с увеличением диаметра фибрилл, что является следствием пониженного синтеза молекул коллагена типа III и протеогликанов, регулирующих упаковку и размеры коллагеновых волокон. При мышечной дистрофии степень упорядоченности коллагеновых фибрилл и волокон снижена в два раза по сравнению с нормой.

Упорядоченная структура коллагеновых фибрилл типа I формируется в процессе эмбриогенеза на начальных стадиях морфогенеза. В процессе тканеобразования клетки передвигаются вдоль коллагеновых фибрилл. Коллагеновые фибриллы типа I интенсивно образуются после ожогов и при заживлении ран.

Для фибрилл коллагена типа I установлена высокая степень упорядоченности в продольном направлении и найдено, что характерная периодичность структуры фибрилл по их длине определяется линейным типом упаковки молекул. До настоящего времени слабо изучена упаковка коллагеновых молекул в поперечном направлении фибрилл, а следовательно, не установлена структура фибрилл в трехмерном пространстве.

6 Упаковка молекул коллагена в фибриллы in vivo определяется достаточно большим числом участвующих в этом процессе компонентов, а также большим числом регулирующих факторов. Поиск условий образования фибрилл, адекватных фибриллогенезу коллагена in vivo, проводится уже в течение ~ 50 лет. Одним из подходов к изучению фибриллогенеза коллагена может быть создание систем фибриллогенеза in vitro в условиях, близких к условиям in vivo. Согласно литературным данным систем самосборки in vitro, параметры которых близки к параметрам in vivo, создано мало (Holmes, 2001; Christiansen, 2000). Выявление параметров образования фибрилл, определяющих функциональное состояние и упаковку фибрилл, позволит приблизиться к пониманию процесса фибриллогенеза in vivo.

Нахождение условий фибриллогенеза, влияющих на плотность упаковки фибрилл, дает возможность получать нативные коллагеновые фибриллы in vitro с регулируемыми свойствами. При создании биоматериалов требуется высокая степень упорядоченности и стабильности коллагеновых фибрилл, чтобы в течение длительного времени сохранялась их устойчивость к действию протеолитических ферментов. Образование коллагеновых фибрилл в комплексе с другими молекулами соединительных тканей представляет важную задачу биотехнологического направления.

Цель и задачи исследования. Фибриллогенез коллагена сложно исследовать, так как нативная структура фибрилл формируется при физиологических температурах, близких к температуре денатурации молекул. In vitro определен ряд параметров самосборки коллагеновых молекул и найдено небольшое число макромолекул внеклеточного матрикса, влияющих на фибриллогенез коллагена. Однако размеры фибрилл in vitro значительно превышают размеры фибрилл in vivo, что вызвано более низкой плотностью упаковки молекул по сравнению с упаковкой молекул in vivo. Целью данной работы является исследование фибриллогенеза коллагена типа І в условиях, приближенных к физиологическим условиям. Для поиска параметров, характеризующих фибриллогенез коллагена in vitro, использованы принципы построения фазовой диаграммы. Решались следующие задачи:

Выяснить влияние температуры на кинетику образования коллагеновых фибрилл.

Определить термодинамические характеристики коллагеновых фибрилл при разных значениях температуры и концентрации молекул.

Установить вклад гликозаминогликанов в формирование термостабильных и устойчивых к протеолизу фибрилл.

Оценить возможности метода калориметрии для изучения структуры коллагеновых фибрилл, образованных in vitro.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Структура коллагеновых фибрилл

Для строения фибрилл характерно ступенчатое расположение молекул со сдвигом на четверть их длины (рис,2). Расположенные в один ряд молекулы не связаны N- и С-концами. Между концом одной молекулы и началом следующей существует промежуток, размером - 40 нм. На электронно-микроскопических снимках наблюдается чередование светлых и темных полос, где светлой полосе соответствует область перекрывания молекул (overlap -зона), а темной полосе - область с промежутками между молекулами (gap -зона). Коллагеновые фибриллы по данным рентгеновской диффракции и электронной микроскопии имеют период поперечной исчерченности D, равный 64-67 нм. Анализ аминокислотных последовательностей полипептидных цепей выявил, что D-периоду соответствует группировка аминокислот в блоки по 234 аминокислотных остатка на а-цепь (Hulmes, 1973; Fraser, MacRae, 1987). В молекуле коллагена четыре таких последовательно расположенных блока. Пятый, С-концевой участок тройной спирали, имеет размер 0,4D и состоит из 90 аминокислотных остатка. На С-участке одной молекулы и перекрывающего его такого же размера N- концевом участке другой молекулы в связывании молекул участвуют глобулярные N- и С- телопептиды (Scott, Orford, 1981; Vitalgiano et al., 1995). Телопептиды составляют 2% от молекулярного веса коллагена, тем не менее они существенно влияют на структуру фибрилл. Включение телопептидов в поперечное связывание молекул способствует не только образованию прочных фибрилл, но и сохраняет им гибкость. В этих участках молекул происходит образование ко валентных связей между тройной спиралью и концевыми телопептидами. 2.3. Упаковка молекул в фибриллах, существующие модели. 2.3.1. Упаковка молекул в продольном направлении фибрилл. В отличие от многих фибриллярных белков образование коллагеновых фибрилл происходит при одновременном росте молекул в продольном и поперечном направлении. Связывание молекул регулируется распределением вдоль пептидной цепи специфично взаимодействующих аминокислотных остатков. Связи образуются как между глобулярными телопептидами и тройными спиралями, так и между тройными спиралями коллагена. Для спираль-спиральных взаимодействий оптимальным является сдвиг молекул на D-период (Ward et al, 1986). D-участок в молекуле коллагена образован в основном гидрофобными и полярными аминокислотными остатками. Гидрофобные аминокислоты имеют более четкий период распределения, чем полярные. D-период является максимумом для гидрофобных контактов при связывании молекул в фибриллы. Гидрофобные взаимодействия минимизируют поверхность коллагеновых молекул, доступную для молекул воды (Wallace, 1985). Последовательный сдвиг молекул коллагена на D-период дает достаточно большой участок (-200 нм) для взаимодействий между соседними молекулами.

Поэтому связывание в длину имеет большие преимущества. Для телопептид-спиральных взаимодействий оптимальным является сдвиг молекул на 4 D (Helseth et al, 1979). В работе (Veis, George, 1994) установлено, что смещение двух молекул на период 4 D связано с максимизацией электростатических взаимодействий в фибриллах. Определено, что максимальные величины положительных и отрицательных зарядов в молекуле локализованы на концах тройной спирали. В молекуле фибриллярного коллагена типа II участки Dl, D4 имеют повышенную стабильность, а участки D2, D3 пониженную стабильность (Arnold et al, 1998). Для коллагена характерна высокая степень упорядоченности в продольном направлении фибрилл - дальнодействующая упорядоченность. Дапьнодействующая упорядоченность регулируется максимизацией электростатических и гидрофобных взаимодействий. В процессах фибриллогенеза электростатические взаимодействия преобладают над гидрофобными, так как в коллагеновых молекулах число заряженных аминокислотных остатков составляет 16 %, а число гидрофобных аминокислотных остатков составляет 6 % (Brodsky et al., 1995). Полярные группы на тройной спирали образованы из аминокислот с чередующимися положительными и отрицательными зарядами. Такое распределение полярных групп приводит к внутримолекулярной нейтрализации зарядов, а также к сильным межмолокулярным контактам. При связывании образуется сеть положительных и отрицательных зарядов, после чего может возрастать отрицательный заряд и энергия связывания между молекулами (Chapman, 1984). Полярные аминокислотные остатки являются гибкими и менее ограничены во взаимодействиях, чем гидрофобные аминокислотные остатки. Полярные группы аминокислотных остатков образуют связи не только между собой, но и с ионами растворов. Известно, что число заряженных групп на тройной спирали коллагена типа I составляет 531(WaIlace, 1990), В то же время разные авторы (Li et al., 1975; Piez, 1982; Silver, 1982) представили данные, что в процессе образования фибрилл связывается 40-150 заряженных аминокислотных остатка. Это свидетельствует, что не все заряженные группы на тройной спирали доступны для взаимодействий между молекулами. Предполагают, что механизм упаковки в продольном направлении включает взаимодействия между необычными блоками заряженных пар, локализованных на тройной спирали коллагена в позиции 53, 54, 56 и 990, 992, а также в неспиральных концах (Silver, 1982). Заряженные пары притягиваются к друг другу либо электростатически, либо в форме гидрофобных кластеров между молекулами. Полярные аминокислотные остатки, вероятно, находятся в протяженной конформации. Так как лизин и аргинин являются наиболее длинными боковыми цепями, возможно, что именно эти аминокислотные остатки притягиваются на начальных этапах образования фибрилл. Перед таким сильным взаимодействием молекулы воды, связанные с этими остатками, должны быть удалены. По-видимому, такой процесс происходит при физиологических температурах. Высокая степень трансляционной симметрии фибрилл по отношению к оси фибрилл, определенная по меридиональным рефлексам под малыми углами, и регулярный D-период указывают на то, что межмолекулярные контакты в продольном направлении особенно предпочтительны.

Это обусловлено комплементарными взаимодействиями между двумя молекулами, а также значительным расстоянием в продольном направлении фибрилл, на протяжении которого распространяется периодический тип межмолекулярного связывания. Получены данные, что свободная энергия зависит от аксиальных параметров, т.е. минимум свободной энергии определен аксиальной составляющей (Wess et al, 1995). Термодинамические исследования формирования фибрилл in vitro как функции плотности коллагеновых молекул показали, что основной вклад в изменение свободной энергии при встраивании молекул в фибриллы дает энтропийная составляющая. При этом энтальпия системы положительна. В построении фибрилл в продольном направлении участвуют N- и С-концевые глобулярные телопептиды. N-телопептид влияет на образование димеров, расположенных с периодом 4D. Сначала N-телопептид на одной молекуле претерпевает конформационное изменение и связывается со спиральной областью соседней молекулы. Затем С-телопептид стабилизирует упаковку молекул в продольном направлении, связываясь с комплементарным участком тройной спирали. С-телопептид влияет также на боковое объединение линейных агрегатов. После самосборки концевые телопептиды способствуют вторичному связыванию молекул и стабилизации фибрилл путем образования новых межмолекулярных связей (Wallace, 1990). Таким образом, концевые телопептиды играют существенную роль как на ранних стадиях образования фибрилл, так и в процессе стабилизации фибрилл. Исследования последних лет свидетельствуют, что молекулы коллагена упакованы не параллельно длине фибрилл, но под некоторым углом в форме спирали. Для оценки упаковки в продольном направлении фибрилл требуются дополнительные данные о пространственной структуре макромолекул, включая углы суперспиральности а-цепей и радиальной ориентации молекул. 2.3.2. Упаковка молекул в поперечном направлении фибрилл. Все взаимодействия молекул в фибриллах принято различать на аксиальные, совпадающие по направлению с длинной осью фибриллы и радиальные -боковые взаимодействия.

Нарушения в упаковке коллагеновых молекул, приводящие к болезням и дефектам соеденительных тканей

Установлено, что нарушения в упаковке молекул коллагена связаны со многими заболеваниями соединительных тканей, из которых наиболее распространенными являются остеопороз, сколиоз, синдром Элерса-Данлоса, синдром Марфана и др. (Никитин и др., 1977; Сиро et al., 1981; Frockop, Kivirikko, 1995). Повышенная растяжимость кожи при синдроме Элерса-Данлоса коррелирует с увеличением диаметра фибрилл до 110-140 нм, который в норме равен 90-100 нм (Kucharz, 1992). Кроме того, в фибриллах нарушается регулярная D-периодическая упаковка молекул. Это может быть следствием заниженного синтеза фибронектина и протеогликанов. Известно, что протеогликаны влияют на упаковку и размеры коллагеновых волокон. В культуре фибробластов in vitro было обнаружено снижение синтеза молекул коллагена типа III, что приводит к изменению соотношения коллагенов типа I и III в коже и в конечном итоге к увеличению диаметра фибрилл. Отсутствие коллагена типа III изменяет упаковку фибрилл таким образом, что диаметр фибрилл существенно увеличивается по сравнению с нормой. Сверхрастяжимость кожи и связок связана с ингибированием поперечного связывания при образовании фибрилл из-за пониженной активности лизилоксидазы, а, следовательно, сниженного числа альдегидных групп в молекулах. На образование фибрилл из молекул коллагена в присутствии pN-коллагена также влияет активность проколлаген-Ы-пептидазы. При пониженной активности фермента значительно нарушается упаковка коллагеновых структур, что приводит к повышенной растяжимости связок при сколиозе и других заболеваниях костно-мышечной системы. Дефекты при синдроме Марфана, которые связаны с аномалиями в тканях глаз, скелетной и сердечно-сосудистой системы, являются также примером изменения упаковки коллагеновых молекул. Повышенная растяжимость тканей связана с пониженной степенью поперечного связывания, которые были вызваны изменениями в структуре а2(1)-цепей. Следовательно, по причине нарушения упаковки тройных спиралей коллагена ослаблены контакты между боковыми цепями аминокислотных остатков в фибриллах. Несовершенный остеогенез относится к группе болезней, связанных как с наследственными дефектами, так и с нарушениями обмена веществ. Наиболее распространенной болезнью является остеопороз.

Наследственные заболевания остеопорозом проявляются не только в повышенной хрупкости костей, но и в истонченной коже, в опалесцирующей зубной эмали и в голубом цвете склеры. Основные дефекты, по-видимому, связаны с коллагеном типа I. Известно, что фибриллы костей состоят только из молекул коллагена типа I. Однако в молодых тканях наряду с коллагеном типа І в небольших количествах присутствует коллаген типа V. При заболевании остеопорозом обнаружено более высокое содержание коллагена типа V по сравнению с нормой, а также коллагена типа III. Молекулы коллагена типа Ш и V могут связываться в фибриллах в gap-зоне, где в норме локализован фосфат кальция, и таким образом могут изменять упаковку молекул коллагена типа І в костях. При остеопорозе обнаружены мутации в генах, кодирующих определенные аминокислоты, как например, глицина (Baum, Brodsky, 1999). Следовательно, изменяется регулярная последовательность триплетов и упаковка молекул в фибриллах. Также обнаружены мутации в генах, приводящие к удалению целых блоков аминокислот, что приводит к укорачиванию а-цепей и изменению упаковки, как молекул, так и фибрилл. Кроме того, при остеопорозе наблюдается пониженный синтез про-а1(І)-цепей, В результате нарушается упаковка тройной спирали коллагена, что впоследствии изменяет упаковку фибрилл. Ненаследственные формы остеопороза, по-видимому, связаны с изменением степени гидроксилирования лизина в молекулах коллагена. Понижение гидроксилирования лизина происходит, когда в организме низкая концентрация Са, что коррелирует с дефицитом витамина D (Кгапе, 1984). Повышение степени гидроксилирования лизина может происходить при заниженной скорости транспортировки про-а-цепей через эндоплазматический ретикулум или в процессе экзоцитоза молекул проколлагена из клетки. При летальной форме остеопороза повышенный уровень гидроксилирования лизина коррелирует с необычно низким диаметром фибрилл (Gay, Miller, 1978). По-видимому, увеличение внутриклеточного разрушения коллагена при пониженной секреции молекул, приводит к низким концентрациям коллагена во внеклеточном пространстве, что значительно изменяет упаковку фибрилл. Методом ренгеноструктурного анализа было показано, что в сухожилиях цыплят с мышечной дистрофией степень упорядоченности коллагеновых фибрилл и волокон снижена в два раза по сравнению с нормой (Stinson, 1975). 2.7. Методы исследования упорядоченных коллагеновых структур. 2.7.1. Метод электронной микроскопии. Большие успехи по установлению упорядоченной структуры коллагеновых фибрилл связаны с применением методов электронной микроскопии и рентгеноструктурного анализа. Так на электронно-микроскопических снимках коллагеновых фибрилл из разных соединительных тканей выявлена одинаковая поперечная исчерченность в продольном направлении фибрилл (Brodsky, Eikenbary, 1982). Основной участок периодической исчерченности D, равный 64 нм, включает светлую и темную полосы, разделенные на субполосы. Исчерченность коллагеновых фибрилл связана с разной степенью окрашивания полярных и нейтральных аминокислотных остатков при получении образцов для электронно-микроскопических исследований.

Для коллагеновых фибрилл типа I, реконструированных in vitro, показано, что связывание красителей с положительно и отрицательно заряженными группами дает 12 полос на D-период. Регулярность D-периода по данным электронной микроскопии варьирует от 50 им до 67 нм. Периодичность в фибриллах, по-видимому, зависит от типа соединительной ткани и возраста животного. Scott et al в 1981г. определили, что у взрослых животных связывание коллагена с протеогликанами в сухожилиях приводит к периодичности 62 нм, а у молодых к снижению периодичности до 50 нм. У новорожденных периодичность еще ниже и составляет 45 нм. Особенностью фибрилл с пониженной периодичностью является высокое содержание хондроитин-сульфата в молодых тканях. Установлено также изменение периодичности до 53 нм в сухожилиях кролика и до 55 нм в коллагеновых фибриллах роговицы. В работе (Scott, 1988) показано связывание протеогликанов с фибриллами молодых тканей вдоль поверхности фибрилл, а также в gap-зоне. Электронная микроскопия определяет не только периодичность упаковки фибрилл, но и фиксирует ассимметричное строение фибрилл, соответствующее ориентации упаковки молекул от N- к С- концу (Kadler et al, 1996). Было показано, что аксиальный рост фибрилл в сухожилиях эмбрионов цыпленка происходит неравномерно на разных концах фибриллы. На электронно-микроскопическах снимках видны несимметричные острый и тупой концы фибриллы, которые называются а- и Р-концами. Сначала рост фибриллы наблюдается на а-конце, затем через некоторое время - на Р-конце. Показано, что оба конца фибриллы эллипсоидны по форме. Это влечет за собой линейную зависимость увеличения массы фибриллы в зависимости от расстояния. Метод электронной микроскопии, фиксируя D-периодичную упаковку молекул, позволяет установить упорядоченную структуру фибрилл в продольном направлении. Однако упаковка молекул в поперечном направлении не сохраняется, что связано к дегидратацией образцов при их подготовке для анализа. Если сравнивать фибриллы по диаметру, то метод электронной микроскопии дает на 10-40% более низкие значения диаметра по сравнению с методом рентгеновской диф фракции.

Выделение коллагена и очистка

Для выделения и очистки белка из разных тканей применяли методики, предложенные авторами работ (Хилькин и др., 1976; Chandrakasan et aL, 1976; Gelman et al., 1979; Veis et al, 1981) и модифицированные в наших работах. Кожу свиньи очищали от жира и волос, разрезали на кусочки размером 5x5 мм. Проводили предварительную обработку ткани раствором 2 % NaOH, в 2,8 % NaSOj в течение 48 час. Экстракт центрифугировали при 7000g в течение 20 мин. Супернатант отбрасывали, осадок обрабатывали 2% раствором борной кислоты до нейтрального рН. Затем промывали осадок дистиллированной водой и обрабатывали 10-кратным объемом 0,5 М раствора уксусной кислоты. Экстракцию проводили в течение 72 час. Для удаления нерастворимого материала гомогенат дважды пропускали через капроновое сито. Проводили осаждение коллагена охлажденным этиловым спиртом до конечной концентрации спирта 30%. Предварительно раствор коллагена подщелачивали раствором 1М NaOH до рН 5,0. Экстракт оставляли на 12 час, а затем центрифугировали при 7000g в течение 20 мин. Осадок растворяли в растворе 0,5М уксусной кислоты. Нерастворимую часть удаляли центрифугированием при 18000g в течение 1 час. Проводили повторное осаждение коллагена охлажденным этиловым спиртом до конечной концентрации спирта 14%. Осадок перерастворяли в 3-хкратном объеме 0,5М уксусной кислоты и диализовали против 40-кратного объема раствора 0ДМ уксусной кислоты с 3-4 сменами раствора. Диализат центрифугировали при 100000g в течение 2 час. Осадок отбрасывали, супернатант использовали для экспериментов. Все процедуры проводили при температуре 4-6С. 3.2.2. Коллаген из сухожилий хвостов крыс 3.2.2.1. Коллаген с телопептидами Коллаген получали из сухожилий хвостов молодых белых крыс. Хвосты замачивали на ночь в дистиллированной воде. Сухожилия выделяли следующим образом: делали продольный разрез хвоста, снимали кожу и, начиная с конца, разламывали хвост на фрагменты и вытягивали сухожилия. Сухожилия промывали в дистиллированной воде и обрабатывали 10-кратным объемом раствора 0,5 М уксусной кислоты. Экстракцию проводили при постоянном перемешивании на магнитной мешалке в течение 72 час в результате 3-х последовательных экстракций, каждая по 24 часа. 1-ый, 2-ой и 3-ий экстракты объединяли и фильтровали через несколько слоев марли. Экстракт разбавляли раствором 0,5М уксусной кислоты и центрифугировали при 30000g в течение 2-х час. Нерастворимые остатки ткани отбрасывали, коллаген супернатанта подвергали 3-хкратной очистке.

Очистку коллагена от примесей и высокомолекулярных агрегатов проводили на разбавленных растворах коллагена концентрации - 1м г/мл. Коллаген получали путем осаждения с последующим центрифугированием и перерастворением в растворе 0,5 М уксусной кислоты. Осаждение проводили раствором 30% NaCI до конечной концентрации 5% NaCI при постоянном перемешивании экстракта на магнитной мешалке и добавлении раствора NaCI из бюретки небольшими порциями. Экстракт оставляли на 12 час. Осадок коллагена отделяли центрифугированием при 7000g в течение 1 час. Перерастворяли коллаген в растворе 0,5 М уксусной кислоты в течение 12 час. Затем проводили диализ в течение 24 час против 40-кратного объема раствора 0,5 М уксусной кислоты с 3-4-хкратной сменой раствора. Диализат центрифугировали при 30000g в течение 2-х час. Верхнюю половину супернатанта использовали для 2-ой очистки по описанной выше процедуре. Нижнюю половину супернатанта с осадком отбрасывали. 3-е осаждение коллагена проводили охлажденным этиловым спиртом до конечной концентрации спирта 14%. Предварительно раствор коллагена подщелачивали раствором 1М NaOH до рН 5,0. Центрифугирование и перерастворение коллагена было выполнено как ранее. Диализ был проведен против раствора 0,1 М уксусной кислоты. Диализованный раствор коллагена центрифугировали на ультрацентрифуге при 160000g в течение 2 час. Верхнюю половину супернатанта использовали для проведения экспериментов. Нижнюю половину супернатанта с осадком отбрасывали. Экстракт коллагена, полученный из сухожилий хвостов крыс, центрифугировали при 30000g в течение 2 час для удаления нерастворимого материала, использовали для получения коллагена без телопептидов. Обработку пепсином молекул коллагена проводили при температуре 25С в течение 24 час следующим образом: пепсин добавляли в 0,5М уксуснокислый раствор коллагена концентрации 1мг/мл, рН 2,5 при соотношении фермент/субстрат 1:10, а через 12 час добавляли то же количество пепсина. Затем проводили инактивирование пепсина раствором О, IN NaOH до рН 7,0 и осаждение коллагена охлажденным этиловым спиртом до конечной концентрации спирта 30%. Осадок отделяли центрифугированием при 7000g в течение 1 часа. Супернатант отбрасывали, осадок коллагена ресуспепдировали и перерастворяли в растворе 0,5М растворе уксусной кислоты на магнитной мешалке. Для удаления телопептидов и примеси пепсина проводили второе осаждение коллагена с последующим центрифугированием, перерастворением в растворе 0,5М уксусной кислоты, диализом и ультрацентрифугированием по описанному ранее методу очистки коллагена типа I. 3.3. Методы исследования 3.3.1. Электрофорез коллагеновых образцов Гомогенность коллагеновых молекул после выделения и очистки, а также наличие разных типов коллагена, были проверены методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. В работе использована стандартная система электрофореза, предложенная Лемли (Lammli, 1970) и модифицированная в нашей работе. Белок находился в растворе 0,02М Na2HP04, 0,15 NaCl, рН 6,0. Образцы коллагена растворяли в 50 тМ трис-HCl, рН 7,5 с 0,5% SDS и проводили нагревание в течение 5 мин. Использовали 3% концентрирующий и 5% разделяющий гели. Окрашивание белков проводили 0,1% кумасси R-250 в системе метанол-уксусная кислота-вода. В качестве маркерных белков использовали, фосфорилазу Ь: мономер (97400 Да), димер (194800 Да), тример (292000 Да), тетрамер (389600 Да). 3.3.2. Определение концентрации коллагена Концентрацию коллагена определяли по сухому весу белка (Kupke D.W., Dorrier Т.Е.,1978) и модифицированному методу Лоури (Stoscheck, 1990). Коллаген в растворе 0,1М уксусной кислоты и в фосфатно-буферном растворе 0,02 М Na2HP04, 0,15 М NaCl, рН 7,2 высушивали при 105С под вакуумом в течение 4-5 суток. Применяли стеклянные бюксы, где бюксы контроля заполняли растворителем. Взвешивание проводили с точностью до ±0,1 мг. При использовании метода Лоури калибровочным белком была желатина. 3.3.3. Оптические методы. 3.3.3.1. Инфракрасная спектроскопия.

Нативность молекул коллагена была проверена по спектрам поглощения в инфракрасной области на спектрометре UR-20 (ГДР). ИК-спектр тройной спирали коллагена характеризуется рядом полос, связанных с колебаниями амидных и пептидных групп а-цепей. Максимум полосы амид А расположен при - 3330 см 1, а максимум полосы амид I расположен при 1665 см 1. Для анализа использовали пленки образцов, высушенные на кварцевых подложках. Подложки помещали в герметичную кювету с постоянной температурой. 3.3.3.2. Спектрофотометр и я Наличие телопептидов проверяли по спектру поглощения тирозина в дальней ультрафиолетовой области на спектрофотометре Specord UV VIS (ГДР). На УФ-спсктрах поглощения молекул коллагена с целыми телопептидами в растворе 6 М Gu-HCl, 0,03 М Na2HP04,pH 6,5 тирозину соответствует основной пик при 276 нм и дополнительный пик при 282 нм (Na, 1988). Использовали концентрацию молекул 20 мг/мл. Кинетику образования фибрилл изучали по изменению мутности растворов коллагена, как изменения оптической плотности, в зависимости от параметров самосборки молекул. Измерения проводили на спектрофотометре Specord UV VIS (ГДР) на длине волны 400 нм. Использовали 0,5 см и 1 см кварцевые кюветы. Перед заполнением в кювету образец дегазировали. Термостатирование образца в кювете проводили с помощью термостата U 8 (Венгрия). Для калибровки температуры использовали полупроводниковое термо сопротивление МТ-54. Точность определения температуры составляла ±0,ГС. Температура образца достигала нужного значения в течение 2 мин. 3.3.3.3. Поляризационно-оптичсская микроскопия Разрушение комплексов коллагена с хондроитин-4-сульфатом под действием коллагеназы исследовали методом поляризационно-оптической микроскопии. Для проведения измерений использовали термомикроскоп типа BOETIUS РНМК-05 (ГДР). Термомикроскоп включает в себя малогабаритный нагревательный стол, встроенное поляризационное устройство и устройство наблюдения. Исследуемый образец помещается между скрещенными полярами.

Влияние температуры и концентрации коллагеновых молекул на кинетику образования фибрилл

Результаты, полученные из кинетических кривых (рис. 9), показывают, что длительность лаг-фазы зависит как от концентрации коллагена, так и от температуры. Увеличение концентрации от 0,3 мг/мл до 1,2 мг/мл (в четыре раза) уменьшает длительность лаг-фазы в два раза, что соответствует увеличению числа контактов между молекулами коллагена и облегчает инициацию самосборки (Silver, ВІгк, 1983). Продолжительность лаг-фазы при Т=30С по сравнению с продолжительностью лаг-фазы при Т=25С уменьшена в пять раз. Обнаруженная зависимость лаг-фазы от температуры определяется конформационными изменениями молекул коллагена (Crabtree, Fujimori, 1980; Helseth, Veis, 1981). С увеличением температуры во время лаг-фазы может ускоряться инициация образования микрофибрилл или рост микрофибрилл до промежуточных фибрилл - субфибрилл (Silver, Birk, 1983). В работе (Suarez et al, 1985) показано, что повышение температуры от 25С до 30С приводит к увеличению скорости образования фибрилл и числа субфибрилл в лаг-фазе. При физиологической температуре возможно быстрое изменение конформации молекул, поэтому самосборка молекул коллагена происходит без лаг-фазы при Т=35С. Данные таблицы 4 показывают, что при Т = 30С параметр Ьл увеличивается в четыре раза, а при Т = 35С - в восемь раз по сравнению с параметром t при Т=25С. Так как установлено закономерное изменение величин Ь/г при всех исследуемых концентрациях коллагена (0,3, 0,6 и 1,2 мг/мл), можно сделать заключение, что, начиная с Т = 30С значительно возрастает скорость образования коллагеновых фибрилл. При Т=35С и концентрации коллагена 1,2 мг/мл образование коллагеновых фибрилл протекает с наибольшей скоростью (параметр Ь/г- 2 мин.). Время формирования стабильной структуры фибрилл, определенное по параметру tp, снижается в три раза с повышением температуры от25Сдо35С. Этими исследованиями показано, что температурой и концентрацией коллагеновых молекул регулируется кинетика процесса фибриллогенеза in vitro. Известна корреляция между температурой, скоростью образования коллагеновых фибрилл и диаметром фибрилл. Wood et al. в I960 г. определили, что повышение температуры от 25С до 37С приводит к увеличению скорости образования фибрилл в 5-8 раз и к снижению диаметра фибрилл в два раза. Кроме того было установлено, что при Т=20 С диаметр фибрилл равен 200 нм, а при Т= 34С равен 20-70 нм, (Kadler et al., 1996).

По нашим данным при Т= 25С фибриллы образуются с низкой скоростью и могут иметь большой диаметр. Но при Т=26С электронно-микроскопическими измерениями выявлена неплотная упаковка фибрилл (Williams et al, 1978). Изменение диаметра ранее (Wood et al, 1960) связывали с изменением упаковки молекул лишь в поперечном направлении фибрилл. Коллагеновые молекулы в фибриллах при физиологических температурах (Т=34С) претерпевают два конформационных перехода: в конце лаг-фазы, а также во время фазы насыщения (George, Veis, 1990). Изменение конформации связано с формированием суперспиральной структуры фибрилл и взаимной подгонкой молекул как в поперечном, так и в продольном направлении фибрилл. Из этого следует, что при физиологической Т=35С возможна более плотная упаковка фибрилл. Структурные изменения в коллагеновых фибриллах при варьировании температуры и концентрации анализировали по данным, полученным из калориметрических кривых. Для кривых теплопоглощения коллагеновых фибрилл характерны асимметричные пики (рис. 10). С ростом температуры от 25С до 35С интенсивность пика перехода и острота пика возрастают, что характеризует повышение степени кооперативности фибрилл. Полуширина перехода AT возрастает в два раза при относительно низких концентрациях коллагена (0,3-0,6 мг/мл) и в полтора раза при относительно высокой концентрации коллагена (1,2 мг/мл), если сравнивать величины ДТ при Т=25С и Т=35С. Термостабильность фибрилл снижается на 1,5С при увеличении температуры от 25С до 35С. Повышение концентрации в четыре раза не влияет на термостабильность фибрилл. Получены результаты о максимальном значении энтропии и энтальпии фибрилл, образованных при температуре 30С (таблица 5). В работе (Na et al, 1989) установлено, что с ростом температуры от 12С до 27,5С величина энтальпии увеличивается. Однако, Cooper в 1970 г. определил, что образование фибрилл при повышении температур от 20С до 37С сопровождается последовательным уменьшением энтропии и энтальпии. По нашим данным увеличение температуры от 25С до 30С приводит к повышению энтропии, а, следовательно, к разупорядоченпости фибрилл. Увеличение температуры от 30С до 35С приводит к снижению энтропии, что характеризует образование упорядоченной структуры фибрилл. Падение энтропии компенсируется падением энергии из-за образования контактов между сближающимися молекулами коллагена. Когда связывание белковых молекул происходит быстро (сек., мин.), тогда падение энтропии быстро компенсируется падением энергии. В таких условиях процесс самосборки молекул не перекрыт высоким свободно-энергетичесим барьером (Финкельштейн, Птицын, 2002). При физиологической температуре 35С образование фибрилл происходит быстро при всех исследуемых концентрациях коллагеновых молекул (мин.) и сопровождается минимальными величинами энтропии и энтальпии. По-видимому, при температурах 250С, 30С и 35С коллагеновые фибриллы формируются разными путями за счет молекул мономерного коллагена, связываемых и не связываемых в фибриллы. Известно, что на количество коллагеновых молекул, связанных в фибриллы in vitro, влияют условия фибриллогенеза (Cooper, 1970; Na, 1989). По данным Cooper при Т=30С количество связанных молекул максимально, при Т=25С их число меньше, а при Т=35С еще меньше. Общая энтальпия фибрилл складывается из энтальпии коллагеновых молекул и энтальпии образования фибрилл. Результаты по энтальпии сидетельствуют, что общая энтальпия может быть изменена за счет вклада энтальпии несвязанных молекул коллагена.

По величине энтальпии возможна оценка относительного содержания нековалентных связей в макромолекулах (Эдсол, 1986). Для анализа процесса фибриллогенеза in vitro важно оценить вклад образующихся межмолекулярных связей. Зная энтальпию денатурации молекул коллагена, можно определить энтальпию образования фибрилл AHf (Tiktopulo et al, 1998). Величины AHf указывают (таблица 5), что количество слабых межмолекулярных связей увеличивается с повышением температуры от 25С до 30С и уменьшается с повышением температуры от 30С до 35С. Если сравнивать влияние температур 30С и 35С на фибриллогенез коллагена в зависимости от концентрации, следует отметить снижение числа межмолекулярных связей в два раза при температуре 35С и концентрации 1,2 мг/мл. В физиологических условиях рН, ионной силы и температуры упорядоченная структура фибрилл формируется за счет снижения количества слабых межмолекулярных связей и более плотной упаковки молекул в фибриллах. Компактность коллагеновых молекул или степень их кооперативности в фибриллах оценивали по числу кооперативных участков, формирующих единую кооперативную систему. Число кооперативных участков в молекулах коллагена, л, при условии, что структурные единицы плавятся независимо, вычисляется по формуле (Lumry et al., 1966): н=ДЯ-М Д774Д-Гт2,(1) где М - молекулярный вес коллагена; R - газовая постоянная; Д// - теплота перехода из нативного состояния в разупорядоченное, рассчитанная на грамм белка; Тт - температура перехода из нативного состояния в разупорядоченное; ДТ- полуширина перехода из нативного состояния в разупорядоченное. При физиологической температуре 35С образование фибрилл происходит быстро при всех исследуемых концентрациях коллагеновых молекул (мин.) и сопровождается минимальными величинами энтропии и энтальпии. По-видимому, при температурах 250С, 30С и 35С коллагеновые фибриллы формируются разными путями за счет молекул мономерного коллагена, связываемых и не связываемых в фибриллы. Известно, что на количество коллагеновых молекул, связанных в фибриллы in vitro, влияют условия фибриллогенеза (Cooper, 1970; Na, 1989). По данным Cooper при Т=30С количество связанных молекул максимально, при Т=25С их число меньше, а при Т=35С еще меньше. Общая энтальпия фибрилл складывается из энтальпии коллагеновых молекул и энтальпии образования фибрилл. Результаты по энтальпии сидетельствуют, что общая энтальпия может быть изменена за счет вклада энтальпии несвязанных молекул коллагена.

Fibra волокно)

структурные единицы коллагенового волокна, состоящие из белка коллагена.

1. Малая медицинская энциклопедия. - М.: Медицинская энциклопедия. 1991-96 гг. 2. Первая медицинская помощь. - М.: Большая Российская Энциклопедия. 1994 г. 3. Энциклопедический словарь медицинских терминов. - М.: Советская энциклопедия. - 1982-1984 гг .

Смотреть что такое "Фибриллы коллагена" в других словарях:

- (fibrillae collagenosae, LNH; лат. fibrilla, уменьшительное от fibra волокно) структурные единицы коллагенового волокна состоящие из белка коллагена … Большой медицинский словарь

- (t. prechondralis; лат. prae перед + греч. chondros хрящ; син. Т. протохондральная) Т. зародыша человека, состоящая из хондробластов и тонких прослоек межклеточного вещества, содержащего фибриллы коллагена; из Т. п. образуется хрящевая Т … Большой медицинский словарь

- (textus, LNH) система клеток и неклеточных структур, объединенных общей функцией, строением и (или) происхождением. Ткань грануляционная (granulationes; син.: грануляции, Т. зернистая) соединительная Т., образующаяся при заживлении дефектов ткани … Медицинская энциклопедия

Врождённая дистрофия стромы роговицы … Википедия

Аггрекан белок, также известный как хрящевой специфичный протеогликановый ядерный белок или протеогликановый хондроитинсульфат … Википедия

Коллаген фибриллярный белок, составляющий основу соединительной ткани организма (сухожилие, кость, хр … Википедия

I Кость (os) орган опорно двигательного аппарата, построенный преимущественно из костной ткани. Совокупность К., связанных (прерывно или непрерывно) соединительной тканью, хрящом или костной тканью, образует Скелет. Общее количество К. скелета… … Медицинская энциклопедия

Или ретикулин термин, обозначающий соединительную ткань, состоящую из коллагена III типа. Ретикулярные волокна формируют ретикулин, то есть сеть, которая составляет основу для ряда мягкотканных органов, таких как печень, костный мозг … Википедия

Коллаген (от греч. Кolla — клей, genes — рождающий) объединяет группу родственных фибриллярных белков соединительной ткани, на которые приходится 25 — 33% всех белков организма. Коллагены — основные гликопротеины кожи, сухожилий, хрящей, связок, костей, зубов, кровеносных сосудов.

Коллаген — основа коллагеновых волокон, которые собраны в пучки различной толщины и образуют в соединительной ткани единую сетчатую структуру. Коллагеновые волокна состоят из мельчайших фибрилл, имеющих высокую механическую прочность и практически не растягиваются. Они поддерживают специфическую структуру органов и тканей в процессе развития и жизнедеятельности организма.

Нативный коллаген устойчив к действию протеолитических ферментов, кислот и щелочей. Углеводные остатки, находящиеся на поверхности фибрилл, защищают коллаген от действия протеаз, поэтому он плохо усваивается в организме. Коллаген нерастворимый в воде, солевых растворах, органических растворителях, в слабых растворах кислот и щелочей, поскольку 70% аминокислот в его составе — гидрофобные. Коллаген способен к набуханию, при этом его масса увеличивается в 1,5 — 2 раза. Высокая гидратация молекулы белка связана с наличием в его структуре значительного количества боковых полярных групп.

Механические свойства коллагена связанные с его первичной и пространственной структурами. Особенностью химического состава является то, что каждая третья аминокислота в коллагене — это глицин, 1/3 — остатки пролина и гидроксипролина, 1% — гидроксилизин, 10% — аланин, остальные — другие аминокислоты. В нем отсутствуют цистеин и триптофан; гистидин, метионин и тирозин содержатся в небольшом количестве. Коллаген — единственный протеин, содержит гидроксипролин. Пептидные цепи белка построены из «триплета», в которых одна из аминокислот – глицин.

В положении Х и У может быть любая аминокислота, чаще Х пролин, В гидроксипролин или гидроксилизин. Эти аминокислотные группы в цепи многократно повторяются. Белковая молекула содержит около 1000 аминокислотных остатков. Каждая цепь образует ливозакручену спираль. Идентифицировано более 20 типов αланцюгив, которые отличаются аминокислотной последовательностью. Шаг одного витка спирали состоит менее чем из 3 аминокислотных остатков, а не 3,6 на 1 виток, как в большинстве белков. Плотная упаковка спирали обусловлена ​​наличием глицина. Пролин не образует водородных связей, поэтому спираль пептидной цепи коллагена стабилизируется за счет стерического отталкивания пиролидинових колец в остатках пролина. Благодаря пролина в полипептидной цепи возникают изгибы, которые стабилизируют структуру спирали. Расстояние между аминокислотами вдоль оси спирали увеличивается, она становится более развернутой, чем αспираль глобулярных белков.

Молекулы коллагена состоят из трех полипептидных αланцюгив, формирующих тройную правозакручену спираль тропоколлагена. В состав коллагенов могут входить три одинаковые или различные цепи. Все три спирали закручены друг вокруг друга, образуя плотный жгут34).

Третичная структура коллагена поддерживается водородными связями, возникающими между амино и карбоксильными группами разных пептидных цепей (С = О НN) и водородными связями внутри каждого полипептида (​​рис. 35).

Все три цепи в молекуле коллагена расположены параллельно — с одной стороны находится Nкинець, с другой — Скинець, все радикалы гидрофобных аминокислот расположены наружу.

Пролин и гидроксипролин ограничивают вращения полипептидной цепи и увеличивают стабильность тройной спирали. Глицин, который вместо радикала имеет атом водорода, всегда находится в месте пересечения цепей, что позволяет им плотно прилегать друг к другу.

По своей природе коллаген — это гликопротеин, содержащий моносахаридными (галактозильни) и дисахаридного (галактозглюкозильни) остатки, соединенные с оксилизина. За счет агрегации молекул тропоколлагена в продольном и поперечном направлениях образуется четвертичная структура коллагена — микрофибриллами, из которых формируются более толстые фибриллы, а из них волокна и пучки волокон. Молекулы коллагена в фибриллы связаны ковалентными связями, возникающими за счет остатков оксилизина.

В настоящее время описано 28 типов коллагенов, которые отличаются друг от друга первичной структурой, степенью модификации — гидроксилирования или гликозилирования, функциями, локализацией в организме. Коллагены делятся на несколько классов в зависимости от их роли в ткани: фибрилоутворювальни, ассоциированные с фибриллами, ситкоутворювальни, микрофибриллами, заякорена фибриллы, трансмембранные домены и другие. Около 95% коллагена в организме человека представлены иииии типами, которые образуют прочные фибриллы и являются основными структурными компонентами сухожилий, хрящей, кровеносных сосудов и другие, а также участвуют в образовании стромы паренхиматозных органов. В одной ткани может преобладать тот или иной тип коллагена. В отдельных органах встречаются коллагены нескольких типов (табл. 7.)

Состав коллагенов в отдельных органах может меняться в онтогенезе или вследствие заболевания.

Существует два типа цепей коллагена — цепи α1 и α2, а также четыре разновидности цепи α1: α1 (I), α1 (II), α1 (III) и α1 (IV). Для обозначения структуры каждого типа коллагена используют следующие обозначения: тип коллагена записывают римской цифрой в скобках, αланцюгы обозначают арабскими цифрами. Например, коллагены II и III типов образованы идентичными αланцюгамы, их формулы соответственно [α1 (II)] 3 и [α1 (III)] 3; коллагены I и IV типов — гетеротримеры, образуются двумя различными типами αланцюгив, их формулы, соответственно [α1 (I)] 2α2 (I) и [α1 (IV)] 2α2 (IV). Индекс за скобкой обозначает количество идентичных αланцюгив. Наиболее распространенный коллаген I типа.

Синтез коллагена

Синтез коллагена происходит в клетках, в основном в фибробластах соединительной ткани, откуда он секретируется во внеклеточное пространство.

Различают внутриклеточные и внеклеточные этапы биосинтеза коллагена, содержащие следующие стадии:

— трансляция;

— посттрансляционной модификации пептидных цепей:

— гидроксилирования пролина и лизина;

— частичный протеолиз — отщепление сигнального пептида

— гликозилирования гидроксилизин;

— образования SSзвьязкив в конечных пропептида;

— формирование тройной спирали;

— трансмембранный перенос;

— внеклеточные модификации — отщепление N и Скинцевих пропептида;

— образование коллагеновых фибрилл:

— окислительное дезаминирование остатков лизина и оксилизина;

— образования поперечных связей между молекулами коллагена;

— образование коллагеновых волокон.

1. Синтез препроколагену. Синтез полипептидных предшественников — проαланцюгив коллагена происходит на полирибосомы, связанных с мембранами эндоплазматического ретикулума (ЭПР). На Nкинци предшественника коллагена находится гидрофобный «сигнальный» пептид из 100 аминокислот. Он предназначен для направления пептидных цепей, синтезируемых в полость ЭПР. Проαланцюг коллагена содержит дополнительные N и Скинцеви пропептида, состоящие из 100 и 250 аминокислот соответственно.

В состав пропептидуС входят остатки цистеина, которые образуют внутренне и мижланцюгови SSзвьязкы. Конечные пропептида не участвуют в формуванння тройной спирали, а образуют глобулярные домены. Отсутствие N и Скинцевих пептидов в структуре проαланцюга нарушает правильное формирование тройной спирали.

Посттрансляционные модификации коллагена

А. Гидроксилирование пролиновых и лизинових остатков начи

ет ся одновременно с синтезом коллагена и продолжается в течение всей трансляции вплоть до отделения полипептидной цепи от рибосом

мы37). Реакцию катализируют микросомальные оксигеназы — пролил4гидроксилаза и лизил5гидроксилаза соответственно. В реакции участвуют: молекулярный кислород, αкетоглутарат и аскорбиновая кислота.

Один атом кислорода используется на гидроксилирование остатков пролина и лизина, второй «включается» в карбоксильную группу сукцината, который вследствие декарбоксилирование αкетоглутарату. Кофактором пролил4гидроксилазы и лизил5гидроксилазы является Fe + +. Аскорбиновая кислота, которая обладает восстановительными свойствами, сохраняет атомы железа в двухвалентное состоянии (фероформи) и тем самым поддерживает активность фермента). Окисленных форма витамина С — дегидроаскорбиновую кислота — снова восстанавливается за счет глутатиона:

После формирования тройной спирали гидроксилирования пролиновых и лизинових остатков прекращается. Гидроксилирования остатков пролина важно для формирования в дальнейшем стабильной тройной спирали коллагена за счет водородных связей, образующихся за счет ОНгруп гидроксипролина. Гидроксилированные и негидроксильовани остатки лизина участвуют в образовании ковалентных связей между молекулами коллагена при формировании коллагеновых фибрилл.

Б. Гликозилирование гидроксилизин. Цепь проколлагена с помощью Nкинцевого сигнального пептида проникает через мембрану в полость ЭПР. После выполнения своей функции сигнальный пептид отщепляется. В полости ЭПР остатки гидроксилизин в проαланцюгах коллагена гликозилюються при участии специфических гликозилтрансфераз.

Галактоза и дисахарид галактозилглюкоза образуют ковалентные Огликозидни связи с SОНгрупамы остатков гидроксилизин38).

Количество углеводных остатков в молекуле зависит от типа ткани, их роль не установлена. Возможно, они отвечают за механические свойства коллагена. Гликозилирования проαланцюгив коллагена завершается после образования тройной спирали.

Синтез и секреция проколлагена. После модификации каждый проαланцюг соединяется водородными связями с двумя другими проαланцюгамы, образуя тройную спираль проколлагена. В правильной ориентации цепей важную роль играют конечные пропептида. Спирализация нитей проколлагена начинается после образования межцепных дисульфидных мостиков между Скинцевимы пропептида цепей за счет SНгруп цистеина. Этот процесс начинается в просвете ЭПР, откуда молекулы проколлагена перемещаются в аппарат Гольджи, включаются в секреторных гранул и выводятся в межклеточное пространство.

Синтез тропоколлагена (растворимого коллагена). В межклеточном пространстве под действием специфических амино и карбоксипептидаз от проколлагена (коллагены типов I, II и III) отщепляются конечные пропептида, в результате чего образуется тропоколлагена — структурная единица коллагеновых фибрилл36). В коллагенов, которые не участвуют в формировании фибрилл (IV, VIII, X), конечные пропептида НЕ отщепляются. Такие коллагены образуют сетку подобные структуры, в формировании которых важную роль играют конечные N и Спептиды.

5. Образование коллагеновых фибрилл происходит спонтанно, путем самосборки. Ряды молекул тропоколлагена в фибриллы расположены параллельно и смещены на ¼ друг относительно друга. У ряда молекулы размещены «конец в конец», но концы не связаны, между ними существуют промежутки в 35-40 нм.

Такая структура фибриллы непрочная («незрелый коллаген»), прочности ей придают внутренне и мижланцюгови ковалентные сшивки, образующихся между остатками лизина или гидроксилизин с участием Сu-содержащего флавопротеинов — лизилоксидазы. Происходит окислительное дезаминирование εаминогруп в остатках лизина и гидроксилизин с образованием альдегидных групп (аллизину и гидроксиаллизину)). Эти группы принимают участие в формировании ковалентных связей между собой и другими остатками лизина и гидроксилизин соседних молекул тропоколлагена.

Многочисленные поперечные сшивки, формирующихся стабилизируют структуру фибрилл образуется нерастворимый коллаген. Количество сшивок в молекуле белка увеличивается с возрастом, что замедляет его катаболизм. Некоторые виды коллагенов не образуют фибрилл.

6. Образование коллагеновых волокон происходит путем агрегации фибрилл36). Они обладают высокой механической прочностью, образуют трехмерную сетку, которая заполняется другими веществами межклеточного матрикса.

Катаболизм коллагена происходит медленно. Протеолитические ферменты тканей и желудочно-кишечного тракта НЕ расщепляют его. Разрушение коллагена вызывают активные формы кислорода и специфические тканевые коллагеназы). Фермент синтезируется клетками соединительной ткани и имеет высокую специфичность). Коллагеназа «перерезает» тройную спираль коллагена (сразу 3 цепи) на расстоянии ¼ от Скинця, между остатками глицина и лейцина (изолейцина).

Фрагменты, образующиеся — водорастворимые, при температуре тела они спонтанно денатурируют и становятся доступными для действия клеточных протеаз (катепсинов).

Регуляция метаболизма коллагена происходит за счет нескольких механизмов:

Отрицательная обратная связь. Коллаген и Nпpoпептиды тормозят трансляцию коллагена.

Действие активаторов и ингибиторов:

 аскорбиновая кислота стимулирует синтез коллагена и протеогликанов, пролиферацию фибробластов;

 витамины РР, В6, ионы Cu + + способствуют «созреванию» коллагена (формированию внутренне и межцепных ковалентных сшивок;

 плазмин, калликреин, катепсин В, ионы Zn — активаторы коллагеназы, т.е. способствуют гидролиза коллагена.

Гормональная регуляция:

— тормозят синтез коллагена на уровне трансляции (уменьшают количество мРНК, кодирующих структуру проколлагена);

— ингибируют посттранслицийну модификацию проколлагена (гидроксилирования остатков пролина и лизина) путем снижения активности пролиллизилгидроксилазы).

Половые гормоны:

— активируют синтез коллагена. Рецепторы к половым гормонам находятся в строме половых органов, фибробластах других органов и тканей;

— эстрогены способствуют синтезу коллагена в коже.

Синтез коллагена увеличивается при заживлении ран, циррозе печени, атеросклерозе, мышечных дистрофиях, в результате чего на месте раны образуется соединительнотканный рубец, погибшие гепатоциты, клетки сосудистой стенки, миоциты замещаются соединительной тканью, в которой фибриллы коллагена расположены хаотично.

Скорость обмена коллагена замедляется с возрастом. У молодых он более интенсивный, чем у людей старшего возраста. Количество поперечных сшивок в коллагене пожилых людей значительно выше, чем уменьшает его доступность для действия коллагеназы.

Нарушение обмена коллагена (коллагенозы) возникают вследствие:

Генных мутаций, приводящих к изменению нативной структуры тройной спирали или неправильного формирования фибрилл коллагена;

Нарушение посттрансляционным модификаций протеина из-за снижения активности ферментов:

Гидроксилирования (пролин, лизингидроксилазы);

Гликозилирования (гликозилтрансфераз);

Пептидаз (Nпроколагеновои и Спроколагеновои);

«созревания» коллагена (лизилоксидазы);

Дефицита витаминов С, В6, меди;

Инфекцийноалергичних заболеваний.

Характерными проявлениями коллагенозов есть повреждения костей, суставов, связок, хрящей, кожи, сосудов, развитие миопатии. Нарушение синтеза коллагена является причиной таких заболеваний, как синдром ЕлерсаДанлоса, болезнь Марфана, несовершенный остеогенез, ревматизм, ревматоидный артрит, системная красная волчанка, системная склеродермия и другие.

Теги: ,

Коллаген (от греч. kolla-клей и -genes - рождающий, рожденный) - фибриллярный белок, составляющий основу соединительной ткани и обеспечивающий ее прочность. Коллаген также содержится в мышечной ткани. Коллаген или тропоколлаген - наиболее распространенный белок животного мира; у млекопитающих во взрослом организме на его долю приходится почти 30% от всей массы белков.

Строение коллагена

Молекула коллагена (молекулярная масса около 300 тыс., длина 300 нм, толщина 1,5 нм) имеет стержневидную структуру и состоит из трех так называемых цепей (молекулярная масса около 100 тыс.), формирующих правозакрученную тройную спираль таким образом, что один виток спирали цепи содержит три аминокислотных остатка. Три цепи в свою очередь объединяются в структуру, слегка закрученную в правую спираль. На рисунке 11 представлена структурная модель коллагена в виде трех отдельных полипептидных цепей. Эти три полипептидные цепи, свернутые в левовинтовую спираль, переплетаются в одну правовинтовую супер - или сверхспираль. Коллаген - один из немногих животных белков, содержащих остатки 3- и 4-гидроксипролина (НО--Pro), а также 5-гидроксилизина (НО--Lys); на них приходится около 21% от всех аминокислотных остатков.

Таблица 3. Содержание аминокислот в коллагене, %.

Аминокислота
Заменимые аминокислоты
Цистеин + цистин
Аспарагиновая кислота
Глутаминовая кислота
Незаменимые аминокислоты
Фенилаланин
Триптофан
Изолейцин
Метионин
Гистидин
Сумма всех аминокислот

Из таблицы видно, что сумма всех аминокислот, входящих в состав коллагена, составляет 100%. Из этой суммы на долю заменимые аминокислоты приходится 72,6%, а незаменимых - 27,4%.

Также из таблицы видно, что содержание заменимых аминокислот больше на 45,2%, чем незаменимых аминокислот, входящих в состав коллагена.

Также видно, что из содержания заменимых аминокислот на долю глицина приходится 26%. Содержание пролина меньше на 10,9%, чем глицина; содержание глутаминовой кислоты меньше на 14,7%, содержание аланина - на 16,5%,а содержание тирозина, серина и аспарагиновой кислоты имеет не значительное содержание по сравнению с содержанием глицина.

Из таблицы можно сделать вывод, что коллаген характеризуется большим количеством глицина, пролина, а также глутаминовой кислоты.

Уникальная особенность коллагена - многократно повторяющаяся последовательность в цепях триплетов аминокислот глицин--X--Y (X, Y-остаток любой аминокислоты, кроме глицина), создающая конформационную основу для спирализации цепей. Триплетная последовательность составляет около 90% всей цепи и расположена в ее центральной части; концевые участки представлены неспирализованными (не содержащими остаток глицина через каждые 2 аминокислоты) последовательностями (так называемые телопептиды). Описано 5 основных и около 10 «минорных» типов коллагена, различающихся по первичной структуре цепей. Коллаген - гликопротеин и в зависимости от источника содержит на 1000 аминокислотных остатков от 2 до 80 углеводных остатков (в основном в виде моно- или дисахаридов), связанных О-гликозидной связью с НО-группой НО--Lys. Моносахариды представлены D-галактозой, которая связана с остатком аминокислоты гликозидной связью. В дисахаридах D-глюкоза связана 1-2 - связью с D-галактозой. Стабилизация молекулы коллагена осуществляется благодаря электростатическим и гидрофобным взаимодействиям, а также водородными и ковалентными поперечными связями между цепями. Водородные связи образованы карбонильной группой и группами NH пептидной связи или НО - группой НО--Pro; возможны также связи с участием Н 2 О. Ковалентные связи между цепями (сшивки) образуются в результате альдольной конденсации остатков 2-амино-6-оксогексановой или 2-амино-5-гидрокси-6-оксогексановой кислот, которые образуются соответственно из остатков лизина или 5-гидр-оксилизина. Сшивки цепей соседних молекул коллагена осуществляются в результате образования альдиминов путем взаимодействия остатков 6-оксогексановых кислот с группой NH 2 лизина или 5-гидроксилизина. В коллагене обнаружены поперечные сшивки, связывающие 3 или 4 цепи соседних молекул. Нативный коллаген плохо растворим в воде при рН около 7. При умеренном нагревании в водных растворах коллаген денатурирует с разрывом нековалентных связей - цепи расплетаются, «плавятся» с образованием желатина. При ренатурации цепи могут образовывать димеры (частицы) или тримеры (g-частицы), которые могут образовывать спираль. Внутриклеточным предшественником коллагена в организме является проколлаген (синтезируется в основном в фибробластах), молекулы которого состоят из трех про -цепей с молекулярной массой 140 -180тыс. Эти цепи содержат на N- и С-концевых участках глобулярные (неспирализованные) последовательности (так называемые пропептиды), отщепляющиеся при внеклеточном «созревании» коллагена. В С-концевых пропептидах локализованы межцепьевые связи S--S, стабилизирующие молекулы проколлагена.

Рис.11.

третичная структура, 2- молекула тропоколлагена, 3- коллагеновое волокно.

Химические признаки коллагена: специфически высокое содержание оксипролина и оксилизина; высокое содержание глицина, пролина, очень малое количество ароматических аминокислот; в нативном состоянии переваривается коллагеназой и не переваривается другими протеазами; обладает специфическими гистологическими свойствами.

Физико - химические признаки: растворяется в горячей воде после обработки кислотами или щелочами в виде желатина или клея, которые осаждаются дубителями; не растворяется в холодной воде.

Физические свойства: специфическая электронномикроскопическая картина поперечной исчерченности; двойное лучепреломление волокон; специфическая рентгенограмма под большими и малыми углами.

Структура коллагеновых фибрилл постепенно изменяется. Увеличивается число водородных и эфирных связей между тропоколлагеновыми молекулами, утолщаются фибриллы (диаметр их увеличивается с 500 на 600 А), за счет этого уменьшается относительная доля основного вещества. Подобен этому механизм поражения клапанного аппарата сердца в ходе развития ревматизма.

Если в молодом детском организме соотношение гексозамин/оксипролин смещено в пользу гексозамина, то с возрастом это соотношение постепенно изменяется в обратном направлении.

Уменьшается скрепляющее основное вещество, а взамен этого сгущаются коллагеновые волокна, изменяется соотношение между ретикулиновыми и коллагеновыми волокнами.

Все это приводит к существенным изменениям реологических свойств соединительной ткани.

Относительно больший процент фибробластов в СТ, т. е. биологически активных элементов в ОВ детского и подрастающего организмов, определяет более интенсивный обмен, а в то же время и более легкую ранимость под влиянием различных вредных агентов.

«Ревматизм в детском возрасте», Стефан Коларов

Расположение пролина в первичной структуре коллагена определяется ДНК и соответственно передается из информационной РНК. Пока еще процесс образования гидроксипролина не вполне выяснен. Внутриклеточно синтезированные полипептиды созревают вне клетки и образуют коллагеновые фибриллы и волокна. Однако поперечная изчерченность коллагена видна уже на этапе образования их внутри клеток. В процессе своего обособления коллаген проходит через следующие этапы:…

Плазминоген-активаторы активируют плазминоген, превращая его в плазмин. Следует подчеркнуть, что протеолитическое действие плазмина не распространяется только на фибриноген и фибрин, но и на ряд других белков. Принимаемая в прошлом, специфичность обусловлена более быстрым расщеплением фибриногена. Предполагают, что плазминоген активируется данной пептидазой, расщепляющей несколько пептидных связей. Наличие тканевых фибринокиназ доказано в ряде органов и тканей —…

Структурные элементы коллагенового вещества Созданная таким образом, нерастворимая коллагеновая фибрилла является основной составной единицей коллагена. Первичная структура коллагена (последовательность аминокислот в белковой молекуле) определяется, прежде всего, часто повторяющимся трипептидом глицил-пролил-гидроксипролином, обладающим определяющим значением и для вторичной и третичной структур. Вторичная структура коллаген обусловливается пространственным расположением составных 1000 аминокислот, которые придают полипептидной цепочке характер спирали. Две…

Мостовые связи, повышающие устойчивость коллагеновых фибрилл Обозначения: а — внутрицепные и внутримолекулярные, обеспечивающие продольную связь; б — межцепные и внутримолекулярные, обеспечивающие поперечную связь; в — межцепные, межмолекулярные, обеспечивающие поперечную связь. Характерной особенностью является расположение глициновых остатков в боковых цепочках внутри коллагеновой молекулы, также как и пролиновых, оксипролиновых и других остатков аминокислот на ее внешней стороне….

Структурная схема коллагенового волокна (по Reed) В сущности последовательность распределения молекул при образовании фибрилл обусловливается, в конечном счете, последовательностью щелочных (основных) и кислых аминокислот в коллагеновой молекуле, т. е. в ее первичной структуре. Объединение отдельных фибрилл в более крупные пучки до обособления коллагеновых волокон, вероятно, осуществляется при участии кислых мукополисахаридов (глюкозами ногликанов). Образование коллагена проходит…